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综述 | TrAC：SARS-CoV2冠状病毒的质谱分析综述
编译：微科盟三金，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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原名：Mass spectrometry analytical responses to the SARS-CoV2 coronavirus in review译名：SARS-CoV2冠状病毒的质谱分析综述
期刊：Trends in Analytical Chemistry
IF：9.801发表时间：2021.05通讯作者：Justin H Griffin, Kevin M Downard
通讯作者单位：澳大利亚悉尼威尔士亲王临床研究科学传染病反应实验室
内容
距离1918年流感大流行仅一个多世纪，随着SARS-CoV2冠状病毒的出现和传播，人们已经意识到未来病毒将大流行的警告已经实现。该病毒于2019年底在中国首次发现并在世界范围内迅速传播，目前已导致超过250万人死亡，约1.13亿感染病例，其中欧美受到的影响尤为严重。据估计，除了全球卫生紧急情况外，全球经济下降了约5％，新冠爆发造成的经济损失超过10万亿美元，只有在20世纪初的大萧条和两次世界大战可以与之相较。全球通过采取一系列分子和非分子分析方法来控制、监测和应对病毒，以此建立了一个统一战线。用于检测和监测病毒的主要技术是基于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的分析和测序。RT-PCR，定量PCR，基于核酸序列的扩增（NASBA），环路介导等温扩增（LAMP）和CRISPR（聚簇的有规律间隔的短回文重复序列）方法都已被应用于临床诊断。质谱法长期以来一直用于病毒的研究和分析，最新设备提高了灵敏度、分辨率和质量准确度，以及具体分析整个病毒及其相互作用的能力。自新冠爆发以来，已有约200篇文章应用不同的质谱方法来表征冠状病毒，并且本综述试图对常规方法进行组织和说明，并探讨了使用质谱分析平台技术进行临床诊断的可能性。
2. SARS-CoV2冠状病毒的结构和组分
质谱分析主要取决于SARS-CoV2的本质。该病毒是一种β冠状病毒，基因组由约30k bp的单链RNA组成，包含10个编码26种蛋白质的基因，其中一些蛋白质是由自切割而来的，此外，还编码一种复制基因组的RNA聚合酶及相关因子、校对核酸外切酶及其他非结构蛋白。其余编码病毒结构成分的基因包括结合宿主细胞受体的表面刺突（S）蛋白，包裹基因组的核衣壳蛋白（N）和包括包膜（E）蛋白的两个膜结合蛋白（M）（图1）。每个病毒蛋白拷贝数约300（S），1000（N），2000（M）和20（E）拷贝，病毒直径约为100 nm，总质量约为1 fg。结构蛋白的分子量分别为141.2kDa（S-由两个亚基S1和S2组成）、45.6 kDa（N）、25.1 kDa（M）和8.4 kDa（E）。高拷贝数的膜蛋白和包膜蛋白，包括表面刺突蛋白有助于质谱检测，尤其是以消化形式检测时。刺突蛋白在病毒表面是三聚体形式，其中的两个亚基（S1和S2）是通过在685-686残基处裂解S蛋白而产生的，每个大小约为70 kDa，可催化病毒附着在宿主细胞的膜上并促进其融合。每个样品的病毒拷贝数对于质谱分析也很重要，通常基于RNA定量评估。病毒载量差异很大，每份样品约为104-1011拷贝（图1）。但是，这些值仅是近似值，取决于初始感染以来的时间和病毒恢复程度。尽管如此，上呼吸道拭子通常含有最高水平的病毒，是质谱下游分析的主要来源。
包括病毒结构、蛋白拷贝数、病毒大小和质量（左），感染部位及不同部位病毒拷贝数（右）。 3.诊断病毒组分的质谱分析
迄今为止，质谱法用于分析检测病毒或一般微生物的蛋白组分分析。蛋白组分分析常见的是将病毒或蛋白组分消化后进行，或者可以直接将样品分离物作为分析物。然后研究者对蛋白质或其肽成分进行MALDI或LC-ESI的单独或组合分析。在这方面，不同的实验室有其特定的习惯，也与质谱仪有关。某些情况下，尤其是在临床实验室环境中，任何生物分子成分（DNA/RNA、蛋白质、脂质等）仅根据其分子量即可用作生物标记，而不需要鉴定该成分的性质。 3.1 MALDI-TOF检测未知潜在生物标志物
有研究报道除了常规的RT-PCR分析外，他们还使用MALDI-TOF MS检测鼻拭子中SARS-CoV-2的方法。在这项研究中，三个通过RT-PCR鉴定为阳性或阴性的来自南美国家的鼻粘液分泌样本作为MALDI质谱实验的样本。虽然没有关于分泌样品中病毒水平的报道，但可以预期它们与从鼻咽拭子获得的水平相对应（图1）。研究者直接对362个样品（包括211个阳性和151个阴性）进行直接MALDI-TOF分析，并根据七个不同m/z值的选定峰进行强度比较，这些峰主要在3000和3500之间，每个峰在m/z 7612和10444处。研究者没有通过鉴别生物标志物，而是通过机器学习方法对七个选定峰进行主要聚类分析（PCA），能够根据离子及其相对平均强度的检测来识别SARS-CoV2存在与否，其中有7％假阳性和5％假阴性（图2A）。当使用来自三个实验室的组合样品进行PCA时，阳性样品和阴性对照的结果无法完全解析，而每个实验室的样品单独处理时也是如此。该研究表明样品中检测到的组分具有高度的可变性，在所有选定的峰中，只有m/z 7612组分（未鉴定）在所有实验室的所有光谱中都是共有的；在m/z 3358处表现出最大的平均强度差，最适合用来区分对照组和SARS-CoV2阳性组。Rocca等人对311例患者标本进行了类似的初步研究。作者使用了从MALDI-TOF光谱中提取的10个峰的强度，并应用了机器学习算法和三种差异分类模型，以评估其在直接从鼻咽拭子样品中检测阳性和阴性SARS-CoV2样品时的性能。使用在3372、3442、3465、3488、6347和10836 Da处出现六个峰的样品，根据其强度降低或在阳性样品中的缺失来评估是否存在感染。报告的整体准确度约为68％（在截止参数范围内，样品的比例反映出60％的正预测值和73.2％的负预测值），但所有峰都不能从分子上归因于病毒特异性蛋白，而是可能与某种类型的病毒宿主成分有关。
结构蛋白成分、蛋白水解肽或整个病毒的主要质谱（MS）方法/工作流程示意图。表征性能（灵敏度、分辨率、动态范围等）取决于MS仪器配置和操作。 3.2 应用MALDI-MS检测病毒蛋白和蛋白水解肽
无论标本来源如何，去除非蛋白质污染物可以改善质谱检测和任何分子测定的可靠性。大量宿主分子的存在会掩盖并抑制低丰度病毒蛋白的离子化。病毒富集和样品净化可显著改善对低丰度病毒蛋白信号的检测，并提高MALDI同一样品不同实验重复性和样品间重复性。Iles等人通过添加低温丙酮从背景宿主蛋白和其他污染物中沉淀出病毒蛋白，离心后回收沉淀重悬。在感染患者的唾液和含漱液样品中，MALDI-TOF检测时低分辨率的S蛋白亚基及其片段S1（m/z 79000）和S2（m/z 62000–72000），还有其他与病毒相关的包膜蛋白片段m/z 26000–47000强度升高（图2B）。这些研究表明，可靠地鉴定病毒组分，特别是在要鉴定完整病毒蛋白的情况下，更高分辨率质谱的重要性。此外，建立SARS-CoV2病毒蛋白质谱参考文库将使人们能够在生物分型实验中更可靠地分配病毒蛋白生物标志物。为了达到此要求，需要以足够的分辨率检测消化的病毒蛋白，以便在大多数基于MALDI-TOF的系统上以合理的可靠性进行鉴定。当在基于傅立叶变换的仪器上使用高分辨率的质量精准度（即离子回旋共振（ICR）或Orbitrap）时，研究者可获得足够准确度的明确分配病毒肽（图2C）。在一项基于MALDI的研究中，研究者在m/z 500-3000的质量范围内分析了整个病毒，检测出了核衣壳蛋白，膜蛋白和刺突蛋白的多肽，典型序列覆盖率约为27％，或者等效于LC-ESI-MS发现的多肽。使用全扫描质谱图时，质量准确度超过3 ppm，而对鼻咽标本的研究发现其检出限超过105个拷贝（与图1相比），而使用选定的离子监控器可以实现更低的限制。重要的是，使用高分辨率质谱法单独通过质谱检测病毒独有肽的能力构成了应用于其他呼吸道病毒（包括流感和副流感）的蛋白分型策略的一部分。 3.3 LC-ESI-MS和串联质谱法检测蛋白水解肽
Nikolaev等人采用LC-ESI MS来检测SARS-CoV2感染患者鼻咽下部和口咽后壁合并粘膜拭子中更丰富的核衣壳蛋白的肽。在这项研究中，病毒蛋白从灭活样品中沉淀出来并立即用胰蛋白酶消化，或者在快速或标准方案中先还原并烷基化再消化。在混合离子流式Q-TOF仪器上研究者记录了14种完全或部分消化的肽的串联质谱（MS / MS），其序列通过将检测到的片段与预测的片段进行比较而得出，而研究者仅在SARS-CoV2阳性样品中检测到了这些不同程度的肽。在对三个SARS-CoV2 感染患者的漱口液样本进行的一项类似研究中，研究者们也检测到了许多相同的肽。这项研究的作者鉴定出源自三个样本中的其中两个样本的独特核蛋白肽，其病毒载量估计为105-106 RNA当量/μL含漱液（参见咽拭子浓度，图1），而在较低浓度（103当量/μL）样品中未检测到。串联LC-MS仪器提供了一种在分析过程中至少部分纯化样品的方法，但是由于LC运行时间和清洗需求，每个样品都需要相当长的分析时间（长达数小时）并在每次运行后需要平衡色谱柱。使用靶向策略，即在平行反应监测（PRM）中检测选定的肽标记物及其片段，可以帮助减少分析时间（图2D）。Cazares等人在模拟感染样本中采用了这种策略，以检测SARS-CoV-2刺突和核衣壳蛋白的肽。根据消化后可重现的产量和低检测限，研究者选择了四种蛋白水解肽，每种分别来自刺突和核蛋白。连续稀释样品后，他们在PRM实验中约200–400 amol的范围内检测到两种这样的肽。在此类模拟样品中，这相当于以高于2×105 pfu / mL的滴定度检测病毒（见图1）。Gouveia等人使用类似的程序来鉴定从细胞培养的SARS-CoV-2病毒样品中的基质、核衣壳和刺突蛋白的14种SARS-CoV-2病毒肽，其中两种与实验组选择的相匹配。在概念验证研究中，同一小组获得了在两个鼻咽拭子中检测到的肽段的MS / MS谱图，但发现只有一小部分肽段序列可被定位到病毒，这引起了对错误发现率的担忧。据报道，在含有特定数量SARS-CoV-2病毒与其他鼻蛋白混合的模拟拭子中，单个核衣壳蛋白的病毒肽低于ng或pfu水平，需要更高数量级的材料来检测以明确分析所需的多种蛋白质的肽。作者在九个阳性临床样本中的两个样本中检测到了病毒肽。Singh等人的另一项研究也使用PRM，他们从刺突中选择了两种肽，并从这些肽和核蛋白的八个肽中选择了一个复制酶多聚蛋白。就RT-PCR证实的阳性样品而言，实现了90% 的检测灵敏度（来自63个样品中的57个）和100%的特异性。这项研究还从SARS-CoV2有症状康复的患者的上呼吸道拭子中检测到这两种肽，且RT-PCR分析检测结果呈阴性，这证明了MS方法在患者中诊断无症状感染者的潜力。研究者采用PRM策略对近1000个样本进行了一项更大规模的研究，通过结合15N标记的标准，在多达84%的阳性病例中定性和定量地检测到 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的肽，特异性高达97%。在这项研究中，使用机器人样品处理器可以每10分钟分析4个样品。 3.4 质谱法检测DNA扩增产物
分析病毒蛋白质成分的一种补充策略是使用质谱法快速检测扩增的聚合酶链反应（PCR）产物。这之前ESI和基于MALDI的仪器已经应用于一系列呼吸道病毒。在基于MALDI-TOF的研究中，连续稀释的质粒溶液包含几乎全长的人类冠状病毒靶基因序列。该方法采用了多重PCR，引物延伸和MALDI-TOF鉴定扩增产物。该方法能够检测到低至10个拷贝的病毒，而使用RNA依赖性RNA聚合酶 (RdRp)、核衣壳(N)基因特异性的引物和延伸探针可以在22% (29/131) 的临床标本中检测到病毒，结果与基因组分析和PCR测序一致。在最近的一项研究中，研究者从已经检测出SARS-CoV-2病毒呈阳性（22）或呈阴性（22）的44个鼻咽或口咽拭子样本中分离并扩增了病毒RNA，并通过MALDI-TOF MS进行了分析（图2E）。该分析法旨在检测以下SARS-CoV-2靶标：病毒核衣壳基因（N1-3碱基分别为28653位-28760位、28880位-28978位、28076位-28190位）；ORF 1ab/nsp3 （碱基为3223位-3335位）和ORF1ab/nsp10（碱基为13342位–13432位）。在两个开放阅读框（ORF1ab和ORF1）和三个阳性样品特有的核衣壳蛋白编码区（N1、N2 和 N3）中检测到五个质量数介于5356和7010之间的扩增子，如果检测到两个或更多扩增，则样品被鉴定为阳性；如果检测到少于两个，则样品被鉴定为阴性。尽管单独RT-PCR分析的总运行时间比与MS检测相结合的时间要短得多（大约80分钟对340分钟），但两者都需要相近的手动干预时间。基于质谱的方法从样品到诊断的周转时间也很短，因此适合常规使用。 3.5 翻译后修饰分析；糖基化和磷酸化
就SARS-CoV2冠状病毒而言，研究者特别关注的是表面刺突蛋白糖基化分布的研究。SARS-CoV-2每个S糖蛋白均含有22个N-连接的糖基化位点，实验证明，其中约19个被糖基化。这些寡糖有助于刺突蛋白折叠，影响宿主蛋白酶的启用，并调节针对病毒的抗体识别。它们参与病毒进入宿主、病毒蛋白的蛋白水解以及宿主免疫系统对病毒的识别和中和。为了解决SARS-CoV-2 S蛋白的位点特异性糖基化并可视化整个蛋白表面的糖型异质性，一项研究使用大小排阻色谱法纯化了重组SARS-CoV-2 S蛋白，以确保天然蛋白三聚体存在；然后分别用三种不同的蛋白酶水解，并通过LC-ESI-MS分析产物。研究者选择这三种蛋白酶以产生包含单个N-连接的聚糖的糖肽。据报道，低聚甘露糖型聚糖在S1和S2亚基中均分散，聚糖含量（28％）高于典型宿主糖蛋白的含量，但低于HIV包膜蛋白的含量。有人提出，这种降低的聚糖屏蔽作用在开发免疫疗法时可能有助于引发中和抗体。第二项研究分别表达了两个亚基，在22个预测的N-糖基化位点中的17个中鉴定了聚糖组成，发现其余5个位点未被占用。尽管有七个位点几乎没有糖基化，但研究者仍在N-糖基化位点观察到了高甘露糖，杂合和复杂类型的聚糖（图3）。S蛋白中17、603、1134、1158和1173位的N-连接残基完全未糖基化。与RBD相邻的234和282处的两个高度唾液酸化聚糖可作为病毒与人血管紧张素酶2（hACE2）结合的决定因素，hACE2是一种I型跨膜金属羧肽酶，附着于位于肺部的细胞膜上，而肺是SARS-CoV2病毒的进入受体。除了在N-糖基化位点看到的复杂异质性之外，该研究还在残基Thr323和Ser325的S1亚基的受体结合域（RBD）中发现了两个意外的O-糖基化位点。N-乙酰基半乳糖胺和神经氨酸糖复合物在前一个残基处占主导地位，而N-乙酰基己糖胺和神经氨酸糖苷复合物在后者残基上被检测到。尽管这些糖基化位点的功能仍是未知的，但有人认为它们可能在屏蔽蛋白表位和帮助免疫逃逸中发挥作用。最近的另一项研究调查了SARS-CoV2表面蛋白和hACE2的翻译后修饰。它为研究宿主附着，由S蛋白和hACE2介导的免疫应答的潜在机制提供了更多的结构细节。研究发现hACE2中的所有七个糖基化位点完全被复杂的N-聚糖占据，但是，这种糖基化作用并没有直接促进S蛋白与hACE2之间的结合亲和力，而该亲和力却受到其他翻译后修饰的影响，包括蛋白质中的多个甲基化位点和hACE2中的多个位点的羟脯氨酸。全球磷酸蛋白质组学调查使用LC-MS揭示了SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞中宿主和病毒蛋白磷酸化。研究者在24小时内的各个时间点收集感染SARS-CoV-2病毒的细胞，并消化裂解细胞后释放的蛋白质，进行色谱分离和磷酸化肽富集后使用LC-MS/MS鉴定宿主和SARS-CoV-2磷酸化的蛋白质。与未感染的对照相比，在与SARS-CoV-2病毒蛋白相互作用的332种人类蛋白的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用图谱中研究者发现了40种感染后发生了显著不同的磷酸化。其中有几种RNA加工蛋白在感染过程中被差异磷酸化，包括LARP1和RRP9。磷酸化在La-基序相关蛋白（LARP）的几个位点上减少，这是一种RNA结合蛋白，可调节特定靶标mRNA的翻译。因此，这可能会增加LARP1对其他非翻译区（UTR）的亲和力，从而导致细胞蛋白合成受到抑制。这些利用蛋白质组学数据深入了解SARS-CoV-2病毒如何劫持宿主细胞的见解为确定有力的治疗干预目标提供了机会。
显示了产生S1和S2亚基的S蛋白的切割位点（在685-686位残基处）。完整的蛋白质编号显示了天冬酰胺（N）连接的和苏氨酸和丝氨酸（T / S）O连接的位点。单糖符号遵循聚糖的符号命名法（SNFG） 4. SARS-CoV2病毒与宿主细胞的相互作用；病毒复制与抑制的蛋白质组学分析
宿主细胞与病毒的相互作用是引起人们极大兴趣的主题，质谱在这个过程中也发挥了作用。一项研究使用了S蛋白的三种糖型模型，基于通过LC-nESI-MS/MS对糖基化位点的质谱分析和分子动力学模拟来检查其与ACE2-RBD的相互作用。ACE2上90位和322位的两个N连接聚糖预计与S蛋白形成相互作用。研究者发现在ACE2 90位氨基酸残基的聚糖足够接近S-三聚体表面以重复形成相互作用，并且在模拟过程中，聚糖臂与表面的多个区域相互作用。此外，他们还反复观察到ACE2 546位的N-连接聚糖与S-蛋白中74位和165位N-连接残基之间的分子间聚糖-聚糖相互作用。蛋白质组学策略已经检查了SARS-CoV-2感染后宿主细胞翻译的变化。Bojkova等人用SARS-CoV-2感染人上皮细胞并培养细胞24小时，在含有同位素的赖氨酸和精氨酸的培养基中发生了明显的致细胞病变作用。与模拟感染对照相比，作者使用LC-MS/MS监测了五种病毒蛋白的水平和翻译速率，方法是对每种独特蛋白确定的所有肽段强度进行求和。为了确定SARS-CoV-2复制的潜在抑制剂，他们确定了丰度轨迹与检测到的病毒蛋白相似的蛋白，以研究可能对病毒扩增具有重要意义的途径。这项研究进一步测试了两种具有不同作用方式的翻译抑制剂利巴韦林和NMS873，发现它们可以阻止病毒复制。在有或没有使用稳定同位素的情况下，定量质谱已开始揭示SARS-CoV-2感染的潜在机制，包括病毒适应宿主的几个关键过程。在另外一个研究中，V'kovski等人在冠状病毒复制酶转录酶复合物（RTC）中采用了酶催化的蛋白质生物素标记，这可能通过亲和纯化和质谱法鉴定生物素化的蛋白来辨别病毒的生命周期（图2F）。 5. SARS-CoV2感染的代谢组学研究
感染患者的代谢组学分析提供了另一种手段，可以更好地了解潜在的病理过程和途径，并鉴定潜在的诊断生物标志物。一项研究采用直接定量（DI）和反相LC-MS/MS的组合，采用靶向定量方法来分析从感染患者血浆中分离出的代谢物。在SARS-CoV2感染的样本中，与阴性对照相比，研究者研究了多达150种不同的内源性代谢物，包括氨基酸，酰基肉碱，生物胺和衍生物，尿毒症毒素，甘油磷脂，鞘脂和糖。研究者对分析物进行了一些衍生和提取，并使用多反应监测（MRM），其中同位素标记的样品和其他内标物用于代谢物定量。他们使用DI-LC-MS/MS和NMR总共检测到183种血浆代谢物，其中8种被发现是阳性冠状病毒疾病感染的最佳指标，其中一个特殊特征是犬尿氨酸。在免疫反应期间，色氨酸的降解增加，而犬尿氨酸也随之增加，这是由病毒感染后从活化的T细胞释放干扰素-γ驱动的。与健康受试者相比，SARS-CoV2 T细胞活化可使危重患者的血浆干扰素-γ升高约10倍。尽管血浆犬尿氨酸的存在可以有效地将感染的患者与健康对照对象区分开，但是通过测量精氨酸/犬尿氨酸的比率可以提高特异性，其中精氨酸/犬尿氨酸的比率在被感染的患者中被显著降低。精氨酸是一氧化氮的氨基酸前体，可增加伤口的血流量和氧气。因此，精氨酸对于组织修复是必不可少的，其敲减可能会潜在地延迟和/或损害患者的康复。 5.1 用于MS诊断的代谢物的呼气分析和纸质喷雾检测
对SARS-CoV2病毒感染进行快速，经济有效和非侵入性分子检测的目的增加了对呼气分析的诉求。通过质谱检测挥发性有机化合物（VOC）已有几十年的历史，但是，由于病毒使用宿主细胞进行新陈代谢，因此不会产生自己的代谢产物，因此尝试使用VOC诊断病毒感染的工作相对较少。各种呼吸采样设备可供非专业人员使用。关键的分析目标是在呼出二氧化碳的一小部分浓度下检测升高或降低的VOC含量。GC-MS提供了一种灵敏且相对较快的方法来分析呼气样品（图4 A）。一项基于GC离子迁移率MS的可行性研究，涉及两个不同中心的98名患者（对冠状病毒呈阳性和阴性，有些表现出其他症状，包括阴性人群中的哮喘），涉及对醛（乙醛、辛醛）、酮（丙酮、丁酮）和甲醇进行多变量分析，来将SARS-CoV2感染与其他条件区分开来。在一组中分离出的未鉴定组分可以预测感染严重程度，而在第二组中鉴定出生物标志物：庚烷。根据MS结果，两组的诊断准确率分别为80％和81.5％。一些在同行评审之前发表的进一步研究指出，此类诊断需要谨慎，并表明需要做更多工作来区分SARS-CoV2感染与其他呼吸道病毒感染以及与吸烟患者相关的并发症。未来在实时呼气分析中使用选择离子流管质谱（SIFT-MS）检测SARS-CoV2也仍有可能，因为该方法在检测潮湿空气中的挥发性有机化合物（VOC）方面具有优势。呼气形式，无需样品预处理或分离。另一种选择是避免使用呼气分析带来的并发症，但仍可以使用纸喷雾质谱法来提供快速的即时检验服务。在这里，分析样品直接沉积在纸或类似的疏水表面上，并使用电喷雾类型的溶剂洗脱（图4B）。DeSilva等人使用防水的Teslin底物，通过线性离子阱的正负质谱分析，检查了感染患者上、下呼吸道混合拭子中的代谢产物和脂质分布。基于相对峰强度的比较，使用线性判别函数分析（LDA）在10个SARS-CoV2感染的样品中鉴定出9种下调的代谢物和22种上调的代谢物。在拭子样本的主要变化中，阳性感染组中十七种脂质的丰度显着升高。根据统计分析，作者报告与PCR分类结果的相关性为93.3％。
（灵敏度，分辨率，动态范围等）效果取决于特定的MS仪器配置和操作。 6. 病毒组分的离子迁移质谱法
尽管对于检测整个病毒颗粒（图2G）及其复合物没有达到相同的质量分辨率和准确度，但是在基于质谱的研究还是有好处的。尽管无法提供相同水平的晶体学和显微研究，但离子迁移质谱法在研究病毒组装、组成、异质性以及结构动力学方面提供了X射线晶体学和冷冻电镜的替代品。离子迁移质谱已用于研究SARS-CoV2刺突蛋白的受体结合域与ACE-2宿主细胞受体的结合。分子建模和IMS的组合用于研究肝素钠在破坏RBD-ACE2缔合中的作用。在初步测试中研究者检测了SARS-CoV2病毒蛋白酶的单体（分子量为33795 Da）和同二聚体复合物及其解离常数。该单元称为主要蛋白酶或Mpro，一种半胱氨酸蛋白酶，可在11个位点切割编码的蛋白，形成12个非结构蛋白（nsp5-nsp16）复合体。但是，通过系列样品稀释和离子迁移质谱（MS）确定SARS-CoV-2 Mpro复合物的解离常数为0.14μM，比通过分析超速离心获得的解离常数低一个数量级，这使人们认为应该谨慎对待这类实验。进行几种候选小分子抑制剂的结合是为了评估它们与SARS-CoV-2 Mpro二聚体结合并抑制病毒复制能力的能力。 7. 病毒蛋白质的进化——质谱数据与蛋白质系统发育
病毒蛋白质进化的系统发育研究是质谱法开始应用的另一个领域。随着世界人口开始接种疫苗，SARS CoV-2病毒的突变现在变得越来越普遍。那些帮助病毒逃避免疫反应，疫苗和/或疗法是最受关注的。一系列研究表明，质谱可用于生成与基于序列的树高度一致的系统发生树。重要的是，非基于序列而是基于质量的进化树（质量树）可以仅通过质量差异的成对比较来确定最常见的氨基酸突变，使用建立的算法还可以在树的分支节点上显示这些差异。这些所谓的质量树可以绘制蛋白质的进化图以及从中衍生出它们的病毒株，然后沿着相互连接的分支追踪非同义的突变模式。祖先和后代突变可以在抗病毒抗药性或其他进化事件的起源的背景下进行研究。该方法的最新应用检查了SARS-CoV2S蛋白的进化。由于突变对病毒的传播性和毒力的影响，这是一个特别令人感兴趣的主题。就通用疫苗的有效性而言，具有高度抗原性预测表位中的区域尤其令人关注。研究者使用该蛋白质在27个病毒株中的质量图谱来构建所示的质量树（图5框内插图）。在树上显示的突变中（图5），该算法正确分配了除四个突变以外的所有突变。这些离群值存在于具有一个或两个其他突变的肽段中，因此它们质量差异的比较并不对应于仅基于质量的可检测到的单点突变。
8. RT-PCR与质谱检测在病毒诊断中的比较
尽管基于RT-PCR的分析仍然是SARS-CoV2病毒分子监测和表征的“金标准”，但该方法不能免除假阳性和假阴性结果。在现实世界中，测试条件远非完美，准确性会受到更高的误报和否定率的影响。RT-PCR分析通常在2-4小时内完成，但这是在对标本进行分析后进行的，并且已经证明了检出限低至大约10份病毒当量（表1）。尽管扩增可以产生额外的拷贝，但是PCR测序对于监测SARS-CoV-2基因组中正在进行的突变也是必要的，部分是为了确定设计的引物和探针是否仍然适合检测突变的病毒株。相比之下，用质谱法直接分析病毒蛋白或它们的肽对应物是检测极限的最大挑战。本文中报道的研究已使用MALDI和LC-ESI-MS方法持续检测到约105份病毒当量（表1）。即使使用选定的离子或反应监测，也只能将预期灵敏度提高一个或两个级别，而检测能力没有其他进步。因此，与RT-PCR分析相比，在质谱技术没有进一步进步的情况下至少需要多一个数量级的材料。相似的检测限度限制了通过质谱法检测DNA扩增子的应用。因此，当样本拷贝数较少时，基于MS的方法可能无法检测到病毒。因此，对于此类样品的分析需要更大的PCR体系和/或更多的PCR循环。像RT-PCR方法一样，如果没有基于基因的测序的检测，基于MS的策略将无法检测新变体。M方法优势的地方在于分析的速度，因为简单的仅质量分析（MS1）可以在几分钟内完成，并且整个过程中样品数量很高，而不是执行PCR所需的小时数（表1）。尽管如此，在定性和定量研究中，质谱在病毒蛋白结构，其结合特性，亲和力和功能研究中的广泛应用远远超出了基于PCR的方法的适用性。质量分析阶段的快速分析时间仅受样品制备以及适用时LC或其他色谱或电泳分离的影响。表1 RT-PCR与扩增子和病毒肽检测在SARS-CoV2诊断中的比较
步骤/参数 | RT-PCR检测 | MS检测DNA扩增子 | MALDI-MS检测病毒肽 | LC-ESI-MS/MS 病毒肽测序 |
病毒回收成分 | RNA | RNA | protein | protein |
回收时间 | minutes | minutes | 1–2 h | 1–2 h |
准备分析步骤 | 逆转录, 变性,退火,扩增b | 逆转录, 变性,退火,扩增b | 有/无还原/烷基化的蛋白水解消化 | 有/无还原/烷基化的蛋白水解消化 |
准备分析时间 | 30 min | 30 min | 4–14 hc | 4–14 hc |
检测时间 | 2–4 h | few minutes | few minutes | 30 min – 1 h |
检测限度(拷贝数) | ~10 | >10–102 | > 105d | 105–106 |
可靠性/置信度 | 超过 95% | 高 (需要多个扩增子) | 高 (需要多个肽) | 高(需要多个肽序列) |
每个样品分析成本(USD) | $10 | $10-50 | $100 | $250 |
仪器成本(USD) | $20 K+ | $100 K+ | $100–1000 K+ | $250–500 K+ |
9. 结论和未来展望
快速而准确地检测病毒是传染病（例如SARS-CoV2）暴发中的一项关键要求。这种检测不仅需要灵敏，而且在适当地灭活病毒后，只需经过很少的培训和专门知识的人员即可进行。就这一点而言，无论是在边境入境点还是在现场的其他地方，现场测试都特别有优势。在这方面，质谱仪的日益小型化和通过纸或便携式MALDI仪器进行快速拭子分析的潜力颇具吸引力。纸浆喷涂或相关技术提供了快速（每样品秒）的分析技术，几乎不需要样品制备，而MALDI策略可以在样品处理量最少的情况下以高通量检测，并且基于ESI的方法更耐盐和其他污染物。固相微萃取拭子与质谱分析的最新结合为病毒分析提供了未来的潜力。MS技术与基于PCR的方法的互补性质使这些方法可以协同工作，以加快对SARS-CoV2病毒的管控和响应。基于MS的病毒肽检测策略已经表明，在多种疫苗和其他混合菌株的情况下，当达到足够的质量分辨率时，就有可能检测出共同感染。这些分析可以得到更多劳动密集型实验室方法的支持，包括GC和LC-MS，以研究疾病预后、评估诊断和治疗的生物标志物以及评估疫苗和治疗的性能。SARS-CoV2感染对宿主细胞的影响以及病毒翻译后修饰（如糖基化）的影响已成为采用多方面质谱技术关注的焦点。MS数据用于研究病毒的进化（包括识别PCR检测可能限制的突变或使病毒能够逃避免疫反应或挑战现有疫苗和/或疗法的突变）具有巨大的未来潜力。毫无疑问，为了更好地应对病毒爆发，质谱和相关“组学”策略的扩展应用肯定会建立在SARS-CoV2大流行之前的基础研究之上。质谱技术越来越广泛地应用于结构蛋白生物学应用，最近使用并列比较的一系列涉及化学和酶处理的方法，也应该有助于我们了解病毒、其分子机制和动力学。
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