科研 | 医科院&协和：来源于血清的细胞外囊泡抑制了 SAPHO 综合征患者的破骨细胞生成（国人佳作）

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨质增生和骨炎（SAPHO）综合征是一种罕见的慢性炎症性疾病，其发病机制尚不清楚。在本研究中，88名SAPHO患者和118名健康对照者被招募来研究血清细胞外囊泡（SEVs）在SAPHO综合征中的作用。基于串联质量标记的SAPHO-SEVs定量蛋白质组学分析揭示了参与骨代谢的差异表达蛋白。其中，血清淀粉样蛋白A-1（SAA1）和C反应蛋白（CRP）上调，酶联免疫吸附试验证实SAPHO患者SAA1水平较高。此外，SAA1水平与CRP呈正相关，CRP是一种与患者病情相关的炎症标志物。体外细胞研究证实SAPHO-SEVs主要在疾病活动期抑制破骨细胞（OC）的生成。进一步分析表明，在SAPHO-SEVs刺激下，活动期患者的破骨细胞中核仁素表达上调。在这项研究中，我们确定SAA1是一个额外的炎症标志物，可能有助于SAPHO综合征的诊断，并推测核仁素是活动期患者破骨细胞生成的关键调节因子。

论文ID

原名：Serum-derived extracellular vesicles inhibit osteoclastogenesis in active-phase patients with SAPHO syndrome译名：来源于SAPHO综合征活动期患者血清的细胞外囊泡抑制破骨细胞生成期刊：Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease
IF：5.043发表时间：2021.04通讯作者：葛微、李忱
通讯作者单位：中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医院

实验设计

实验结果

1. 项目设计
研究设计的流程图如图1所示。我们用超速离心法或适当试剂分离41例SAPHO患者和56例健康者血清SEV。超速离心分离的SEV用于TMT定量蛋白质组学，试剂分离的SEV用于western blot、NTA和促进成骨和破骨细胞生成。Western blot检测EV标志物CD63和ALIX的表达。我们用NTA法测定了EV的粒径和浓度。为了验证SAPHO SEVs中SAA1水平较高的质谱结果，我们用ELISA法对54例SAPHO患者和84例健康对照者的血清样本进行了分析。我们对36例SAPHO患者和11例健康者进行了SEVs在骨代谢中的作用的研究，从36例SAPHO患者和10例健康者中分离的PBMCs可以被诱导形成OCs，而健康者的骨髓间充质干细胞被诱导形成成骨细胞(OBs)。我们分别用TRAP染色和茜素红S染色观察SEVs对破骨细胞和成骨细胞的影响。在探讨SEVs对破骨细胞生成的影响时，我们发现SAPHO-SEVs抑制了24例SAPHO患者的OC分化；这些患者被分为响应组。另12例SAPHO患者在SAPHO和健康SEV刺激下无明显变化；这些患者被归类为无响应组。统计分析和定量蛋白质组学被进一步应用于解释SAPHO患者对SEVs反应的临床和分子机制。图1 项目工作流程
SEVs，血清来源的细胞外泡；EV，细胞外囊泡；NTA，纳米颗粒跟踪分析；UC，超速离心法；TMT，串联质标记；LC-MS/MS，液相色谱串联质谱；GO，基因本体；STRING，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析(版本11.0)；PBMCs，外周血单个核细胞；ADMSCs，脂肪组织来源间充质干细胞；OC，破骨细胞。 2. SEV验证
使用试剂分离的SEV被用于Western blot和NTA分析，Western blot分析显示EV标记CD63和ALIX均在SEV颗粒部分富集，但在整个血清和上清液部分中不富集（图2a）。NTA显示，健康对照组和SAPHO患者中SEV的平均粒径分别为176 nm和152 nm（图2b），两组之间无显著差异（图2c）。此外，健康对照组和SAPHO患者之间的SEVs颗粒浓度没有显著差异（图2d）。通过超速离心纯化的SEV用于基于TMT的定量蛋白质组学。我们在健康对照组和SAPHO患者中共鉴定出1620个蛋白质，其中803个可信蛋白质被鉴定（得分10，独特肽2），然后我们将可信蛋白的Uniprot登录号导入到768个Entrez基因ID上。基于Entrez基因ID，768个蛋白质中有692个（90%）与ExoCarta数据库重叠（图2e）。GO分析表明，SEV中的总蛋白主要富集于补体激活、Fcγ受体信号通路和蛋白质水解等免疫调节相关过程（图2f），位于细胞外基质、细胞外区域、细胞外空间和外泌体（图2g）。这些蛋白质的分子功能是抗原结合、肝素结合和参与细胞粘附的钙粘蛋白结合（图2h），这些数据表明从血清中纯化EVs是成功的。 图2 血清源性细胞外囊泡（SEV）的纯化与鉴定
（a）纯化的SEV通过EV标记物ALIX和CD63的western blot检测得到证实。从每个样品中装载等量的蛋白质。SDS-PAGE分离的总蛋白用考马斯蓝染色。（b）对SAPHO患者和健康对照组的SEV进行纳米粒子跟踪分析（NTA）。（c ）两种SEV的粒径。（d）两种SEV的粒子浓度。（e）SEVs蛋白与ExoCarta数据库的重叠蛋白。（f-h）基于生物过程（f）、细胞成分（g）和分子功能（h）的质谱鉴定SEVs蛋白的GO注释。 3. SAPHO-SEV中DEPs的特征
根据材料和方法部分的标准列表，在SAPHO SEV中筛选出49个DEP，其中10个蛋白上调，39个蛋白下调（补充表S2）。GO分析显示下调的蛋白质在以下生物过程中富集：血小板脱粒、信号肽处理、肽基-谷氨酸羧化和细胞外基质组织（图3a）。除了胞外空间、胞外区域和外泌体外，下调蛋白还位于EVs生成细胞器中，例如内质网腔、血小板α颗粒腔和高尔基体腔（图3a）。此外，富集的分子功能与骨代谢有关，如内肽酶抑制剂活性、钙离子结合、胶原结合和肝素结合（图3a）。上调的蛋白在任何GO项目中均未显著富集，但CRP和SAA1这两种急性期蛋白与免疫应答和炎症高度相关。基于STRING数据库的蛋白质相互作用分析表明DEPs之间有密切的相互联系（图3b）。 4. SAA1在SAPHO患者中高表达
CRP是SAPHO患者中与高水平疾病活动相关的实验室炎症指标。然而，SAA1和SAPHO之间的关系仍然不清楚。为了探讨这种关系，我们用ELISA方法分析了54例SAPHO患者和84例健康对照者的SAA1水平。与健康对照组相比，SAPHO患者血清和SEVs中的SAA1水平均升高（图3c和3d），然而，在疾病的静止期和活动期之间没有显著差异。此外，受试者操作特征（ROC）曲线分析表明，SAA1可用于区分SAPHO患者和健康对照，精确度适中，血清SAA1的曲线下面积（AUC）为0.62，SEVs SAA1的AUC为0.71（图3e和3f）。血清SAA1的最佳临界值为1539.47 ng/ml，特异性为0.88，敏感性为0.35。SEVs的最佳临界值为15.12 ng/mg，特异性为0.68，敏感性为0.65。Pearson相关分析显示SAA1与血清CRP呈正相关，在血清（r=0.48，p=0.0002，图3g）和SEVs（r=0.47，p=0.0003，图3h）。这些结果暗示SAA1作为一种额外的炎症标志物，可能有助于SAPHO的诊断。 图3 SAPHO-SEVs中DEPs的生物学分析
（a）基于生物过程、细胞成分和分子功能的SAPHO-SEVs质谱鉴定DEPs的GO注释。（b）利用STRING在线工具构建了SAPHO-SEVs中DEPs的蛋白质相互作用网络。红色代表上调，蓝色代表下调。与骨代谢有关的蛋白质显示在黄色文本中。（c）ELISA法检测健康人和SAPHO患者血清SAA1水平。（d）ELISA法检测健康对照组和SAPHO患者血清SEVs-SAA1水平。在（c）和（d）中，将患者进一步分为静息期组和活动期组，并比较SAA1水平。（e、f）血清SAA1（e）和SEVs（f）的ROC曲线分析用于SAPHO诊断。（g、h）CRP水平与血清SAA1水平（g）和SEVs-SAA1水平（h）的Pearson相关分析。 5. SAPHO SEVs可在疾病活动期抑制SAPHO患者的破骨细胞生成
在49个DEPs中，18个蛋白质（37%）被鉴定为骨代谢调节因子，它们被标记为黄色的串联网络（图3d）。蛋白质在骨代谢中的作用详见表1，这一结果表明SEVs在SAPHO相关的骨代谢异常中起作用。表1 与骨代谢相关的DEPs 
为探讨SEVs对SAPHO患者破骨细胞生成的影响，纯化PBMCs，诱导OC分化。在24例（2/3）SAPHO患者中，SAPHO-SEVs显著抑制破骨细胞的生成。TRAP染色显示SAPHO-SEVs刺激下的OCs明显少于健康SEVs刺激下的OCs（图4a）。然而，在其他12例患者中，SAPHO患者和健康对照组的SEV刺激的OCs之间没有显著差异（图4b）。OC面积和数量的详细统计结果如图4c所示，SAPHO-SEVs抑制OCs者为响应组，OCs无变化者为无响应组。所有36名SAPHO患者OCs的代表性TRAP染色图像如补充图S1所示。为探讨临床因素与患者反应的潜在相关性，我们比较和评估响应组和无响应组SAPHO患者的临床特征（表2）。卡方检验显示，患者反应与BASDAI评分（r_s=0.378，p=0.023）、ASDAS评分（r_s=0.359，p=0.031）和CRP水平（r_s=0.347，p=0.037）有关。根据BASDAI评分（8/8）或ASDAS评分（13/15），几乎所有活动期患者都在响应组内。静息期患者中，有响应组与无响应组患者无显著性差异，分布基本均匀。这表明处于活动期的SAPHO患者比处于静止期的SAPHO患者更容易受到SAPHO-SEVs对破骨细胞生成的影响。此外，患者的反应与人口统计学特征（如性别和年龄）和骨代谢标志物（如骨钙素和β-CTX）无关。表2 患者反应与临床特征的关系 
6. SAPHO SEVs对健康人破骨细胞和成骨无影响
我们在11名健康人中评价SEVs对骨代谢的作用。TRAP染色显示，健康和SAPHO SEVs都促进OC分化，但两种SEVs的作用没有显著差异（图4d-f）。10个健康对照组的代表性TRAP染色图像如补充图S2所示。为了评价SEVs对健康人成骨的影响，我们进行了体外成骨实验。来自健康对照组的人ADMSCs与β-GP、L-AA和地塞米松在有或无SEVs的情况下诱导OB形成，在24天后出现钙结节，我们用茜素红S染色，结果表明，在PBS、SAPHO患者的SEV或健康对照组的SEV刺激下形成的钙结节没有显著差异（图4g和4h）。这些结果表明SAPHO-SEVs对健康人的破骨细胞生成和骨生成过程没有影响。 图4 SAPHO-SEVs抑制处于疾病活跃期的SAPHO患者的破骨细胞生成
（a、b）在SEVs刺激下，响应组（a）和无响应组（b）患者OCs的代表性TRAP染色图像。每个患者的TRAP染色图像如补充图S1所示。（c）OC数和面积的计算与比较。每名健康SEV刺激的患者OCs的平均数目或面积被标准化为1。（d）健康对照组在SEVs或PBS刺激下OCs的代表性TRAP染色图像。（e、f）OC数（e）和面积（f）的计算和比较。在每个健康对照组中，由健康SEV刺激的OCs的平均数目或面积被标准化为1。（g）SEVs和PBS刺激下人ADMSCs分化成骨细胞钙结节茜素红S染色图像。（h）SEVs和PBS刺激下ADMSCs分化成骨细胞钙结节面积的计算与比较。 7. SAPHO-SEVs刺激患者OCs抗原呈递相关蛋白表达下调
为了阐明SAPHO患者对SEVs反应的分子机制，我们分析了响应组和无响应组SAPHO患者OCs之间的蛋白质组学差异（图1）。已确定的总数和DEP见补充表3。TMT-131/129和TMT-130/126的比值分别作为SAPHO-SEVs引起的响应组和无响应组的变化表征。我们根据95%预测区间筛选出响应组和无响应组的DEPs，蛋白质表达热图显示响应组和无响应组的DEPs之间存在显著差异（图5a），两组间上调和下调蛋白的重叠分别小于18%和34%（图5b和5c）。响应组DEPs的蛋白质相互作用网络显示，下调的蛋白在抗原加工和递呈过程中富集，包括MHC I类蛋白（HLA-A、HLA-C、LILRB4、TAPBP）、MHC II类蛋白（HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-DPA1、CD74）和Fcγ受体家族蛋白（FCGR1A和FCGR3A）（图5d）。 8. 核仁蛋白是响应组患者在SAPHO SEVs刺激下参与破骨细胞发生的核心蛋白
在SAPHO-SEVs刺激下，响应组患者OCs中上调的蛋白质在细胞过程中富集，包括染色质组织、前体mRNA过程、mRNA前处理、核糖体组织和线粒体。这些蛋白质通过核仁素（NCL）连接（图5e）。western blot分析证实SAPHO-SEVs刺激的响应组OCs具有较高的NCL水平。相反，在无响应组中，SAPHO-SEV刺激的OCs和健康SEV刺激的OCs之间的NCL水平没有差异（图5f）。 图5 响应组患者OCs中DEPs的生物信息学分析
（a）SAPHO-SEVs刺激下有响应组（131/129）和无响应组（130/126）OCs中DEPs的热图。（b、c）响应组（131/129）和无响应组（130/126）上调蛋白（b）和下调蛋白（c）的Venn图。（d、e）SAPHO-SEVs刺激下响应组患者OCs中下调蛋白（d）和上调蛋白（e）的蛋白质相互作用网络。（f）SAPHO-SEVs刺激下响应组患者OCs中NCL上调的western blot验证。SAPHO-SEVs对无响应组NCL表达无影响。灰度分析结果以点图显示。

讨论

1. SAA1作为炎症标志物可能有助于SAPHO综合征的诊断
SAPHO综合征是一种慢性炎症性疾病，涉及骨、关节和皮肤，病因和发病机制尚不清楚。SAPHO综合征的诊断主要依据临床表现和影像学或磁共振成像。由于SAPHO综合征的临床表现多种多样，且与其他已确定的疾病类别具有相同的特征，因此准确诊断SAPHO综合征仍然具有挑战性。目前，对SAPHO还没有专门的实验室诊断试验。尽管非特异性炎症标志物如CRP和ESR的实验室检测通常用于评估患者的病情，但研究者尚未发现与SAPHO的一致相关性。循环中较高浓度的急性相蛋白SAA1与炎症有关，如类风湿性关节炎（RA）和强直性脊柱炎（AS）。在目前的研究中，使用54名SAPHO患者和84名健康对照者，我们发现SAPHO患者的SAA1水平升高，并且与CRP水平相关。ROC曲线分析表明，SAA1对SAPHO患者与健康对照组的鉴别具有中等的准确性。此外，为了评价SAA1是否也能区分SAPHO和其他炎症疾病，我们招募了22例RA和29例AS患者，并检测了他们的SEVs-SAA1水平。我们发现SAPHO、RA和AS患者的SAA1水平比健康对照组高；然而，SAPHO、RA和AS患者之间未发现显著差异，尽管SAPHO中的SEVs SAA1水平略高于RA和AS患者，尤其是AS患者（补充图S3）。由于患者数量和疾病类型的限制，我们无法得出明确的结论。因此，要确定SAA1是否可以作为辅助SAPHO诊断的一个额外的炎症标志物，需要更大的样本量和更多的疾病类型。Wekell等人报道，SAA1在监测SAPHO综合征的改善期（静息期）和复发期（活动期）时，似乎是比CRP更敏感的炎症标志物。然而，我们的小规模研究表明，SAPHO患者在疾病活动期和静止期的SAA1水平没有显著差异，这与Wekell等人的发现不一致，可以推测这种差异是由于这两项研究的重点不同，我们的研究比较了不同患者在静息期和活动期的SAA1水平，而Wekell研究了同一患者在疾病进展过程中SAA1的动态变化。这种差异也可能与这两项研究样本量的巨大差异有关，Wekell等人的研究只招募了两名患者，因此，SAA1是否可以作为疾病活动的监测指标还有待研究。
2. SAPHO SEVs可抑制疾病活跃期患者的破骨细胞生成
SAPHO综合征是一个稳定的实体，具有良好的长期预后。SAPHO综合征患者的骨关节研究在5年多里依然没有进展。少数患者经过3-6个月的有限疗程后达到无病状态，而且大多数患者都有一个慢性病程，其特征是间歇性发作和短期改善。在活动期（加重期），胸锁关节发生骨溶解，引起疼痛。一段时间后，骨溶解消失，疼痛因不明原因减轻，患者进入休息期（改善期）。这种复发-缓解过程和良好的预后表明，病人可能有自救能力。目前，从活动期到静止期的调节机制尚不清楚。我们的结果显示SAPHO-SEVs特异性地抑制处于活动期的患者的成骨，暗示SEVs中的一些未知因素可能诱导从活动期到静止期的转变。
3. NCL在活跃期破骨细胞形成中起作用：SEVs刺激下的患者
NCL是真核细胞中主要的核仁蛋白，参与染色质解聚、核糖体合成和成熟。我们的蛋白质组学数据分析显示NCL是pre-RNA加工、核糖体和染色质组织相关蛋白的核心蛋白，这与以前的报道一致。线粒体是OC分化的关键细胞器，线粒体中的蛋白质也通过HSPA9与NCL相连。此外，在我们之前的研究中，我们观察到在骨质疏松症和骨质疏松症患者中高水平的NCL蛋白，表明NCL促进破骨细胞的生成。这些结果暗示NCL是一种新的OC分化调节因子，可能通过调节染色质组织、前mRNA加工和线粒体来实现。然而，需要进一步的研究来阐明NCL在OC分化中的确切作用。
4. SEV负调节活动期SAPHO患者的免疫反应
EVs参与多种生理过程，免疫细胞和非免疫细胞的囊泡在免疫调节中都起着重要作用。经免疫的血源性EV已被证明可降低对特定抗原的主动免疫反应。据推测，SEV抑制机体对外周自身抗原和常见外来抗原的反应，从而抑制慢性炎症和自身免疫。SAPHO通常被认为是一种自身炎症综合征，伴有促炎症细胞因子（IL-1、IL-8、IL-17和IL-18）和Th17细胞升高，暗示患者处于高度炎症状态。事实上，SAPHO患者大多患有长期慢性炎症。抗原呈递细胞在炎症状态下表达更高水平的MHCⅡ类蛋白，从而增强自身抗原呈递，暗示SAPHO患者可能有自身免疫反应。然而，目前的报告表明，SAPHO患者自身抗原含量没有明显增加。OCs来源于单核细胞/巨噬细胞，继承了单核细胞作为抗原提呈细胞的特性，包括吞噬病原体和通过MHC家族蛋白向T细胞提呈抗原的能力。在本研究中，SAPHO-SEVs降低了MHC和FCGR家族中蛋白质的OC表达，这在抗原提呈过程中起着重要作用。我们推测SEVs可削弱SAPHO患者自身抗原呈递能力，从而改善SAPHO患者对自身抗原的反应。此外，先前的研究表明，MHCⅡ类蛋白的丢失不会改变破骨细胞的形成和成骨；因此，我们推测SAPHO-SEV同时调节抗原提呈过程和破骨细胞生成，而不是因果关系。SEVs对抗原呈递的影响也可能促进SAPHO患者从活动期向静止期的转变。进一步研究SAPHO-SEVs在抗原呈递中的作用可能有助于进一步了解SAPHO综合征的发病机制和潜在的治疗策略。
5. 局限性
由于SAPHO是一种罕见的疾病，本研究中患者的样本量是有限的。SAA1被认为是一种非特异性的炎症标志物，在RA和as等多种炎症性疾病中表达升高。SAPHO的特异性诊断标志物不仅应能区分SAPHO与健康状态，还应能区分临床表现与SAPHO相似的其他炎症相关疾病，包括RA和AS。因此，我们在RA和AS患者中也检测到SEVs-SAA1水平，得到了一些初步的结果。但由于受患者数量和疾病类型的限制，无法得出明确的结论。因此，需要进一步研究更大的样本量和更多的疾病类型，以确定SAA1作为炎症标志物是否有助于SAPHO综合征的诊断。

结论

本研究推测SAA1作为一种额外的炎症标志物，可能有助于SAPHO综合征的诊断。本研究还表明SAPHO-SEVs抑制活动期患者的破骨细胞生成，并证明NCL在这一过程中作为核心调节因子的作用。然而，需要进一步的研究来评估SAA1的诊断性能，并充分阐明SEV影响破骨细胞生成的具体机制。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33948126/

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