科研 | Ecotoxicol Environ Saf.：全氟辛酸在巨噬细胞中的免疫代谢调节和免疫毒性评价（国人佳作）

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

全氟辛酸(PFOA)是工业中最常用的全氟化学品之一。近年来，全氟辛烷磺酸的毒性引起了广泛关注。然而，关于全氟辛烷磺酸免疫毒性的报道相当有限。本研究旨在研究PFOA暴露对巨噬细胞RAW264.7的免疫毒性。我们评估了PFOA暴露对巨噬细胞活力、细胞凋亡和细胞ROS水平的影响，并检测到RAW264.7中细胞因子显著性释放。结果表明，PFOA能显著降低RAW264.7巨噬细胞的活力，且呈剂量和时间依赖性。其中，200 μM PFOA显著增加巨噬细胞凋亡和ROS生成，从而导致细胞损伤。ELISA结果显示，100 μM PFOA暴露诱导巨噬细胞活化，增加细胞因子分泌，包括TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12。我们还基于LC-MS/ MS进行了非靶向代谢组学研究，揭示了10 μM和100 μM的 PFOA诱导巨噬细胞代谢通路紊乱。结果表明，10 μM PFOA暴露显著影响谷氨酰胺相关代谢途径，100 μM暴露显著改变谷胱甘肽和脂肪酸氧化代谢。这些结果表明，10 μM PFOA暴露可促使巨噬细胞代谢重编程触发炎症反应，但对RAW264.7巨噬细胞活力、细胞ROS和凋亡事件均无明显影响。

论文ID

原名：Immunometabolism-modulation and immunotoxicity evaluation of perfluorooctanoic acid in macrophage译名：全氟辛酸在巨噬细胞中的免疫代谢调节和免疫毒性评价
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872发表时间：2021.06通讯作者：洪燕君、刘建军、蔡宗苇
通讯作者单位：中山大学药学院(深圳) 、深圳市疾病预防控制中心和北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院

实验设计

实验结果

1. PFOA影响RAW264.7细胞的活力
我们使用不同剂量的PFOA(100、200、400、800、1600 μM)分别对RAW264.7巨噬细胞进行24、48和72 h的免疫细胞毒性评价。如图1A所示，PFOA抑制巨噬细胞增殖的作用呈时间和浓度依赖性。与对照组相比，800和1600 μM剂量的全氟辛烷磺酸(PFOA)暴露24或48 h后诱导细胞死亡显著(p <0.0001)。PFOA暴露72 h后细胞活力下降更明显，从200 μM浓度开始显著下降。800 μM PFOA处理72 h后，约80%的细胞死亡。总的来说，超过400 μM剂量的PFOA降低了巨噬细胞活力，这与之前使用人类外周血单个核细胞(PBFC)的研究一致。此外，PFOA还以浓度和时间依赖性方式影响巨噬细胞活力。结果表明，中等浓度(400 μM以下)PFOA处理后的巨噬细胞活力没有明显下降。为了进一步考察PFOA在巨噬细胞中的细胞毒作用，我们检测了RAW264.7的凋亡事件。 图1 PFOA对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性评价
(A)细胞生存能力测定巨噬细胞治疗与全氟辛酸及其盐类(PFOA) 24日,48和72 h。(B) RAW264.7细胞凋亡事件分析接触PFOA 24 h。(C)统计凋亡的巨噬细胞治疗PFOA 48 h。(D)代表流式细胞术的照片RAW264.7细胞凋亡分析24 h后接触PFOA。(E, F, G)流式细胞术评价细胞内ROS。(E, F) RAW264.7未处理和PFOA处理4 h和24 h后ROS水平的统计分析。(G) RAW264.7经不同浓度PFOA处理24 h后的DCF荧光图。 2. PFOA诱导RAW264.7细胞凋亡
为了研究PFOA的细胞毒性机制，通过流式细胞仪检测PFOA对RAW264.7细胞的凋亡作用（图1B和D）。在暴露24小时后，PFOA在200、400和800 μM剂量下诱导RAW264.7细胞凋亡显著增加（图1B），且浓度依赖。当PFOA剂量大于200μM时，48h后细胞凋亡明显（图1C）；此外，与24 h相比，200和400 μM PFOA暴露48 h不仅触发巨噬细胞凋亡，而且显著增加了细胞坏死(图1C)。PFOA暴露24 h后RAW264.7细胞凋亡分析的代表性流式细胞术图像如图1D所示。FITC -Annexin V阳性信号提示细胞凋亡发生在早期，而PI阳性信号提示细胞发生坏死。同时具有FITC和PI信号的细胞为凋亡晚期细胞。结果表明，亚致死剂量(200 μM ~ 400 μM) PFOA处理的巨噬细胞凋亡明显增加。这表明一定的PFOA暴露似乎对巨噬细胞活力没有影响，但实际上导致了细胞凋亡的发生。因此，仅用细胞活力来评价PFOA的细胞毒性是不全面的。
3. PFOA诱导RAW264.7细胞氧化应激
流式细胞术检测巨噬细胞RAW264.7的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)。在处理4和24 h后，高剂量(400 μM) PFOA诱导RAW264.7细胞内ROS显著升高(图1E&F)。图1G中合并了不同浓度PFOA处理24h后RAW264.7细胞的DCF荧光图。 4. 基于LC-MS/MS的PFOA作用后整体代谢组学分析
为了进一步研究PFOA亚致死剂量暴露对巨噬细胞的影响，我们采用基于MS的整体代谢组学分析方法，对巨噬细胞代谢发生的事件进行了分析。低浓度(10 μM和100 μM)的PFOA处理24 h对RAW264.7细胞无抑制作用。代谢组学数据PLS-DA评分图(图2A &B)表明暴露组与对照组明显分离，正离子模式下R2X = 0.377, R2Y= 0.906, Q2 = 0.496，负离子模式下R2X = 0.555, R2Y= 0.915, Q2 = 0.742。我们对模型进行200次排列检验，以评估模型是否过度拟合。Q2分布的Y轴截距在正、负模式下均小于零(图2C&D)，表明PLS-DA模型的可靠性。值得注意的是，我们在10 μM和100 μM PFOA暴露组之间观察到明显的代谢谱差异，这意味着PFOA在代谢紊乱中存在剂量依赖效应。此外，根据VIP值大于1的阈值，选择有助于PLS-DA区分和聚类的代谢特征。火山图中显示了p<0.05和FC>1.2或FC<0.8的显著紊乱特征（图3）。y轴火山图显示p值，x轴显示各代谢特征的倍数变化。蓝色圆点代表FC<0.8和p<0.05的代谢特征，橙色圆点代表FC>1.2和p<0.05的代谢特征。图3A和B显示了在正离子模式下获得的差异代谢特征，图3C和D显示了在负离子模式下获得的差异代谢特征。与10 μM相比，100 μM PFOA对代谢产物的影响更大，说明PFOA存在剂量依赖性效应。 图2 采用PFOA治疗的RAW264.7的代谢谱的多变量统计分析
RAW264.7细胞正(A)、负离子(B)代谢组学数据PLS-DA评分图。正离子(C)、负离子(D) PLS-DA 200次置换试验验证图。 图3 正离子模式(A)下不同组间代谢特征变化的火山图;(B)和负离子模式(C) & (D).每个点代表不同的代谢特征，橙色代表上调的代谢特征，蓝色代表下调的代谢特征。
 5. PFOA对代谢产物和代谢途径的干扰
见表S1是鉴定出的差异代谢物(15个上调，7个下调)，包括氨基酸、核苷、有机氮化合物等，其中有22种代谢物受到干扰。此外，我们在处理后的RAW264.7细胞中检测到PFOA浓度是对照组细胞的数千倍(图S1)，这表明PFOA可以被RAW264.7细胞吞噬。我们鉴定并富集差异代谢特征，进一步分析代谢通路。结果表明，10 μM PFOA处理后主要干扰了D-谷氨酰胺和谷氨酸代谢、赖氨酸降解和氨基酰基- tRNA生物合成(图4A)。在100 μM PFOA暴露的巨噬细胞中，高剂量暴露时嘌呤代谢、脂肪酸代谢特别是谷胱甘肽代谢明显受到干扰(图4B)。与未处理的巨噬细胞相比，PFOA改变的代谢物的相对数量呈倍变化(图5)，主要包括氨基酸、核苷和有机氧化合物。图4 基于已鉴定的代谢物生物标记物的通路分析
(A) 10 μM PFOA处理RAW264.7 24 h的影响通路。(B) 100 μM PFOA处理RAW264.7 24 h的影响通路。 图5 全氟辛酸对氨基酸、核苷及其他重要代谢产物的影响
 6. 细胞因子检测
我们采用ELISA试剂盒检测巨噬细胞RAW264.7释放的细胞因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α。与未处理的巨噬细胞相比，100 μM PFOA处理RAW264.7后的细胞因子分泌明显增加(图6)。此外，10 μM PFOA处理后的巨噬细胞IL-12分泌也明显高于对照组(图6D)。然而，200 μM PFOA处理组和对照组之间TNF-α(图6A)、IL-1(图6B)和IL-12(图6D)没有显著差异，但IL-6水平高于对照组(图6C)。 图6 ELISA分析不同剂量PFOA刺激RAW264.7巨噬细胞释放IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α的结果
(A) PFOA刺激RAW264.7释放TNF-α的水平。(B) PFOA刺激RAW264.7释放IL-1。(C) PFOA刺激RAW264.7的IL-6释放。(D) PFOA刺激RAW264.7释放IL-12。

讨论

巨噬细胞的活动（包括活化、生长和增殖）与细胞的动态代谢密切相关，并依赖于细胞的动态代谢。我们发现，高剂量的PFOA暴露显著改变了代谢成分，但该剂量对细胞凋亡和活力没有影响。巨噬细胞内代谢产物分析也表明PFOA具有剂量依赖性的免疫毒性。应该强调的是，表面上简单的代谢途径选择实际上对辅助代谢过程的结果有重大影响。因此，基于非靶向代谢组学数据中鉴定的变化代谢物进行代谢途径分析，将有助于更好地理解PFOA免疫毒性的机制。谷氨酰胺在氨基酸代谢和氮代谢中发挥重要作用，能够保护细胞免受谷氨酰胺合成酶催化的氨毒性影响。在10 μM PFOA处理细胞中谷氨酰胺降低表明酶活性降低或氨积累增加的可能性。更重要的是，谷氨酰胺对巨噬细胞的免疫功能至关重要，包括细胞因子和一氧化氮诱导。在10 μM PFOA暴露的巨噬细胞中，谷氨酰胺含量的降低意味着硝酸盐或亚硝酸盐更倾向于生成气态氮化物，它们作为活性氮化物(RNS)损害细胞，而不是以还原形式与氨基酸结合。亚硝化应激对巨噬细胞的影响与其对LPS的免疫应答和抗菌活性相似。100 μM PFOA处理后巨噬细胞中谷胱甘肽水平明显升高，说明巨噬细胞能促进抗氧化防御，控制ROS应激，减少自身氧化损伤。这也可以通过使用流式细胞术检测ROS获得的结果来支持，100 μM PFOA处理后的巨噬细胞ROS生成量与对照组无明显差异(图1 E, F)。除了谷胱甘肽代谢外，巨噬细胞的脂肪酸氧化通路也受到影响。在100 μM PFOA作用后促进脂肪酸氧化，这能够支持巨噬细胞活化M2表型。M2巨噬细胞抑制炎症信号依赖于脂肪酸氧化程序，而不是经典活化巨噬细胞M1使用的糖酵解。事实上，巨噬细胞一方面需要通过快速诱导ROS/RNS来清除感染抗原，另一方面也需要产生抗氧化剂来防止组织过度损伤。综上所述，10 μM PFOA暴露在巨噬细胞中可能触发RNS应激并诱导免疫应答，100 μM PFOA暴露可能导致巨噬细胞中谷胱甘肽和脂肪酸氧化代谢升高，以控制ROS应激并抑制炎症信号。这表明PFOA暴露通过改变细胞内代谢影响巨噬细胞免疫活性，即使在对巨噬细胞活力没有明显损伤的剂量下也是如此。值得注意的是，巨噬细胞的代谢重编程在调节其表型和功能中起着主导作用。事实上，免疫细胞中代谢通路之间的复杂联系对相关免疫功能至关重要。代谢重塑是免疫细胞免疫应答所必需的。巨噬细胞在各种类型的免疫细胞中的促炎和抗炎反应中具有核心作用，其可以响应环境信号并呈现多种不同的命运，例如由不同细胞因子促进的M1和M2。这是巨噬细胞分泌细胞因子和发挥免疫功能的重要途径。有趣的是，巨噬细胞响应抗原诱导的细胞因子与细胞代谢中发生的特异性活性紧密相连。在这种情况下，我们分析了巨噬细胞释放的一些主要细胞因子，以鉴定PFOA对免疫代谢和免疫功能的影响。我们检测暴露于PFOA后抗原呈递细胞释放的细胞因子对揭示受抑制的抗原特异性抗体反应的细胞信号通路至关重要。巨噬细胞可强烈表达TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等细胞因子，影响白细胞，调节炎症反应。这些极有效的功能分子具有很强的相互关系，在急性或慢性免疫反应中起着至关重要的作用，并在抗感染和外源性刺激的免疫和炎症反应中形成中枢部分。更具体地说，TNF-α参与全身炎症，通常与IL-1和IL-6共同参与。IL-1在升高体温和促进白细胞外渗过程中发挥重要作用，使白细胞从循环系统转移到先天免疫应答的关键部位。IL-6是促炎细胞因子，可以刺激免疫反应和对抗感染。TNF-α和IL-1可以诱导IL-6的产生，协同负责急性期蛋白的合成。IL-12具有诱导免疫应答的能力和抗血管生成活性，并能刺激和增强其他免疫细胞的细胞毒活性，包括淋巴细胞T细胞和NK细胞产生TNF-α。巨噬细胞表达的这些细胞因子在炎症和抗感染免疫反应的调节中形成主要部分。为了更好地了解RAW264.7中没有明显细胞损伤的PFOA剂量下巨噬细胞的免疫应答，我们分析了主要细胞因子的释放。结果表明，PFOA能在相应的低浓度下增加巨噬细胞RAW264.7炎症因子的表达，但细胞活力似乎不受影响。Son等人也报道了类似的结果，他们发现PFOA暴露小鼠免疫器官中TNF-α、IL-1和IL-6等细胞因子增加。Qazi等人也发表了一致的发现，PFOA增强了雄性小鼠腹腔巨噬细胞中炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达。此外，在10 μM PFOA处理的巨噬细胞中，IL-1并没有明显增加，这可能是由于谷氨酰胺的减少，Wallace等报道了充足的谷氨酰胺是巨噬细胞产生IL-1应答抗原的必要条件。200 μ M处理巨噬细胞RAW264.7后，IL - 1、IL - 12、TNF - α等细胞因子的释放无明显变化，这与该剂量诱导细胞凋亡，损伤巨噬细胞的免疫能力受到一定程度的损伤有关，暗示其他免疫细胞如T细胞的功能紊乱。当T细胞逐渐进入功能失调状态时，会破坏氧化能力和线粒体质量，最终无法满足维持效应器功能的能量需求。200 μM PFOA暴露后巨噬细胞IL-6分泌增加，可能是TNF-α和IL-1共同促进作用的结果。值得注意的是，仅10 μM PFOA刺激就能提高IL-12的分泌，这表明10 μM PFOA可能开始增强其他免疫细胞的细胞毒性活性，如淋巴细胞T细胞和NK细胞，从而诱导免疫应答。综上所述，我们的研究表明PFOA暴露在高剂量下损害巨噬细胞活力，在低浓度下诱导炎症反应。同时，PFOA暴露引起巨噬细胞的代谢重编程从而促进相关免疫反应(图7)。值得注意的是，巨噬细胞在抗感染和宿主防御方面发挥着显著的作用，它增强了对污染物、微生物等外源性物质的应答生理活性，巨噬细胞分泌的细胞因子对其他类型的免疫细胞至关重要。因此，PFOA诱导巨噬细胞活力下降，导致免疫能力受损和其他免疫细胞免疫功能障碍，从而增加感染和超敏的风险。目前我们完成了免疫代谢相关工作，下一步将继续研究代谢选择如何影响免疫细胞的功能、命运和效率。 图7 PFOA暴露诱导巨噬细胞免疫毒性和代谢重编程
PFOA暴露诱导巨噬细胞RAW264.7的免疫毒性和代谢活性的改变。巨噬细胞的代谢重编程改变了细胞因子的分泌，这可能导致其他类型的免疫细胞的其他功能障碍。

结论

本研究采用传统毒理学方法和基于MS全局代谢组学方法研究PFOA对巨噬细胞的免疫毒性。我们从免疫代谢的角度阐明PFOA免疫毒性及其机制。PFOA能浓度依赖性和时间依赖性地降低巨噬细胞的活力，细胞损伤是由ROS增加和凋亡引起的。我们还对PFOA刺激巨噬细胞RAW264.7的细胞因子分泌进行了评估和讨论。值得注意的是，全球代谢组学数据显示，低剂量的PFOA改变了巨噬细胞的免疫代谢，从而诱导了免疫反应。这些结果表明，环境PFOA暴露可能导致免疫紊乱的风险。然而，我们的工作是基于一种类型的巨噬细胞进行探索性研究，这种巨噬细胞在人体免疫相关效应评估中的预测性较差。因此，从不同类型的免疫细胞获得的数据对于验证隐含的途径是必不可少的。本研究的免疫结果可丰富全氟辛酸的毒理学数据库，为全氟辛酸的免疫毒性评估提供有价值的信息。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33773150/

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