科研 | Metabolites：稳定同位素分解代谢组学测定脂质转换的NMR方法

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

脂类包括对膜的结构和性质非常重要的多种化合物，如高能燃料源和信号分子。因此，这些不同种类脂质的周转率是细胞功能的基础。然而，它们巨大的化学多样性和细胞内的动态范围使得详细的分析非常复杂。此外，尽管稳定同位素示踪剂能够测定复杂脂质的合成和降解，但可分辨分子的数量却大大增加，这加剧了问题的严重性。尽管液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）是脂质组学的标准，核磁共振（NMR）可以增加全球脂质分析和完整脂质同位素分布的价值。在这里，我们描述了NMR分析的新进展，用¹³C₆葡萄糖和¹³C₅谷氨酰胺示踪剂评估两个细胞系（PC3和UMUC3）的总脂质含量和复杂脂质混合物的同位素富集。

论文ID

原名：NMR Methods for Determining Lipid Turnover via StableIsotope Resolved Metabolomics译名：通过稳定同位素分解代谢组学测定脂质转换的NMR方法
期刊：Metabolites
IF：4.931发表时间：2021.03通讯作者：Andrew N. Lane
通讯作者单位：美国肯塔基大学

实验设计

实验结果

1. NMR分析
高分辨率串联质谱可以提供关于复杂混合物中特定脂质种类的非常详细的信息，从而提供关于代谢亚单位的标记模式的信息。然而，这种方法不太适合解决大量脂质的问题，包括主要的代谢亚单位标记（例如，甘油与酰基链）和复杂脂质类（例如，磷脂酰胆碱和胆固醇）的相对丰度。我们已经发展了一种方法，通过NMR快速估计¹³C在复杂脂质体的不同亚基中的掺入。利用细胞磷脂酰胆碱脂类（PCs）作为内标物，我们可以快速评估¹³C掺入不同功能组的普通脂类。由于哺乳动物细胞不具备从头合成胆碱的能力，细胞内的所有胆碱甲基都处于自然丰度（1.07%）。质子谱中其它物种的峰强度与PC-甲基峰强度之比代表未标记物种，HSQC谱中的峰强度反映标记物种。这两个比率之间的关系给出了特定基团的¹³C分数富集。此外，通过比较胆碱峰与甘油或胆固醇峰的强度，可以估计这些类脂的相对数量。 图1 从UMUC3 WT（野生型）细胞中提取的脂质的1D NMR光谱
从在[U-¹³C]-葡萄糖存在下生长的细胞中提取脂质，干燥，并在d4甲醇中再溶解。NMR谱在15℃下采集，1D ¹H-NMR采集512个瞬态，采集时间为2 s，14368个点，谱宽为12 ppm，弛豫延迟为4.0 s。数据为线性预测，零填充至65，根据文献和我们的内部标准数据库，536个数据点和分辨率良好的峰被标记为如图所示。¹H PRESAT谱：（A）显示酰基链和胆固醇共振的Upfield区域。垂直标度被扩展以显示与1.32 ppm的CH₂共振相比较小的峰。（B）显示甘油头基团区域的下视野区域；插图显示双键和甘油C2区域。分配显示在图中。1.4和2.2 ppm处的尖锐共振（星号）来自BHT。 2. 葡萄糖和谷氨酰胺中¹³C掺入的¹H NMR研究
我们用[U-¹³C]-葡萄糖或[U-¹³C]-谷氨酰胺示踪剂（U=均匀标记）处理两种不同的细胞系（PC3和UMUC3）。提取细胞脂质并用¹H NMR进行分析，以获得最大灵敏度。然而，由于¹³C脂质物种的总体比例较低，并且与其他信号严重重叠，这些合并物种的¹³C卫星峰难以量化。图1显示在[U-¹³C]-葡萄糖存在下生长的PC3脂质的1D ¹H光谱。我们在0.8到3 ppm的范围内观察到酰基链（图1A），包括末端甲基、大部分CH₂和附着到C2、C3和C4的分解质子。此外，胆固醇-甲基共振在0.7和1 ppm时得到很好的分辨。¹³C卫星峰由于其低强度以及与其它信号的重叠，在这些光谱中很难分辨。胆碱和乙醇胺基共振以及磷脂的甘油主链亚单位的共振在3到5 ppm之间（图1B）。在质子光谱中，只有一个甘油头基团C1卫星峰很容易观测到（图1B）。C3卫星峰是可见的，但很难量化，因为它与周围的峰重叠。为了更清楚地确定标记模式，我们记录了二维TOCSY和HSQC光谱，其显示了甘油脂质中甘油亚基的所有C1、C2和C3位置的清晰交叉峰模式和适当的化学位移。TOCSY光谱（图2A，B框）显示在[U-¹³C]-葡萄糖存在下生长的细胞提取物的甘油亚基（>50%，表1）中可重复且实质性的¹³C标记，在未标记培养基或含有[U-¹³C]-谷氨酰胺的培养基上生长的细胞提取物中不存在。HSQC光谱（图2C）证实了在1D和TOCSY光谱中观察到的峰的归属。TOCSY谱中的¹³C卫星峰可以进行体积积分，以提供甘油亚单位的位置（同位素）富集。TOCSY光谱还显示了酰基链的一些分辨率，最显著的是在不饱和位置、末端甲基以及酰基链的C2、C3、C4位置（图2A）。然而，在这些细胞中，酰基链的标记很低，因此TOCSY和1D质子谱的整合即使不是不可能的，也是不可靠的。然后我们转向使用1D ¹³C{¹H}-HSQC光谱评估¹³C掺入，如方法中所述。 图2 在[U-¹³C]-葡萄糖上生长的PC3细胞提取的脂质的¹H-TOCSY和¹H{¹³C}-HSQC光谱
在15℃、14.1 T下记录TOCSY光谱，t2中的采集时间间隔为1 s，t1中的采集时间间隔为0.04 s，混合时间为50 ms的DIPSI2（存在标量相互作用时的去耦）自旋锁，B1场强为6.5 kHz。在质子尺寸为12 ppm，碳尺寸为200 ppm的情况下获得了2D-HSQC光谱。采集时间F2为0.25 s，F1为8.5 ms。采用绝热解耦，并设置3.425 ms的传输延迟（对应于146 Hz）以获得最佳的单键CH耦合。（A）全谱显示复合脂质的不同亚群。（B）下行区扩展显示甘油亚基中的交叉峰和¹³C卫星峰，以及胆碱头基的交叉峰。绿色虚线框表示甘油主链中的双标记相邻碳。（C）HSQC谱证实了PRESAT和TOCSY谱的归属。 表1 NMR测定两种细胞系（WT：野生型和KO：敲除型）脂质亚群中¹³C分数水平的总结脂质亚组¹³C水平按正文（方程式（1）和（2））中所述进行计算，并以脂质中不同位置总碳的百分比表示（三份标记样品的平均标准偏差，每组只有一份未标记样品）。
3. ¹H{¹³C}-HSQC法测定葡萄糖和谷氨酰胺中¹³C掺入量
将在[U-¹³C]-葡萄糖或[U-¹³C]-谷氨酰胺存在下生长的PC3和UMUC3细胞的脂质提取物的1D HSQC光谱与在图3和图S3中未标记葡萄糖存在下生长的相同细胞进行比较。如图3所示，在[U-¹³C]-葡萄糖上生长的细胞提取物显示出比[U-¹³C]-Gln或未标记样品更强烈的甘油峰。结果表明，葡萄糖样品中的各种酰基链峰也更为强烈，表明¹³C显著并入脂肪酰基链。如方法部分所述，计算每个位置的实际¹³C掺入量。从表1可以清楚地看出，在这两种在¹³C葡萄糖上生长的细胞系中，甘油头基团高度富集（超过50%），因为它们来自于二羟丙酮-3-磷酸，这是糖酵解的中间产物。这些结果与质子谱和二维TOCSY谱中这些基团的卫星峰峰的积分非常吻合。我们从一个WT PC3样品的TOCSY光谱（图2A）中量化了中心未标记峰和¹³C卫星峰，发现甘油C1基团¹³C富集度为60.31%，C2基团富集度为51.26%，C3基团富集度为59.57%，这些与1D-HSQC计算的数据非常接近（62.7%，50.4%和66.7%）。此外，所有未标记样品和位置的天然丰度¹³C水平平均为1.08±0.37%（表1），与预期值1.07%一致。这表明我们用一维HSQC估算部分富集度的方法是可行的。为了进行比较，我们还记录了在[U-¹³C]-葡萄糖存在下生长的PC3细胞脂质提取物的直接观察¹³C光谱，该光谱需要18小时采集，以获得与1D HSQC相当的信噪比（图S4）。我们用同样的方法来测定¹³C掺入UMUC3细胞。在甘油-C1组，我们发现野生型细胞中[U-¹³C]-葡萄糖的富集率为59.3%±0.9%，在UMUC3敲除细胞中的富集率为52.8%±1.28%，与[U-¹³C]-Gln样品的自然丰度没有差异（表1）。甘油碳的¹³C标记与WT PC3细胞（62.3±1.2%）相似，但略低于PC3 KO细胞（65.2±0.88%）。这表明使用由葡萄糖新合成的G3P，甘油脂质池的转化率很高。相比之下，脂肪酸链中大量CH₂基团的标记要低得多，约为4–5%。末端甲基显示约2–3%的标记，表明这些细胞中脂肪酸链的从头合成相对较低。同时，由于糖酵解和PDH活性中新合成AcCoA的延伸，酰基链羧酸端附近的C2和C3基团的标记率更高（C2为7–9%，C3为4–6%）。在存在[U-¹³C]-Gln和未标记葡萄糖的情况下生长的细胞中，甘油基团没有显示出明显的标记（即接近自然丰度）（图4，表1），表明这些细胞中很少有新生的糖异生，正如先前在乳腺癌细胞中观察到的。然而，由于柠檬酸盐产生的胞浆AcCoA可能来自谷氨酰胺的还原代谢，并从线粒体或交换通量中运输出来，因此脂肪酸链富集到约34%。在[U-¹³C]-葡萄糖示踪实验中，PC3和UMUC3细胞系中的甘油基部分富集相似。相反，PC3细胞中的CH₂比UMUC3细胞中的CH₂更富集。与UMUC细胞相比，PC3细胞中脂肪酸链的C2和C3含量更高，表明PC3细胞中的脂肪酸延伸反应更活跃。在[U-¹³C]-谷氨酰胺示踪剂实验中，PC3中不同脂肪酸组的标记通常低于UMUC3，并且在这两种情况下都不太高于自然丰度。对于标记的样品，在UMUC3细胞中，胆固醇18和19甲基的¹³C丰度高于4-5%的自然丰度，而在PC3细胞中则较低（2-3%）（表1），表明在UMUC3细胞中，AcCoA进入胆固醇合成的通量较高。图3 在[U-¹³C]-葡萄糖、[U-¹³C]-谷氨酰胺或无示踪物中培养的WT或KO PC3细胞脂质提取物的1D ¹H{¹³C }-HSQC谱
在0.25 s的采集时间内，用¹³C绝热解耦法记录1024次扫描（34分钟采集）的光谱。光谱宽度设置为12 ppm，与质子光谱相同，循环延迟设置为1.75 s。共收集1796个数据点，并用4 Hz谱线展宽指数将零点填充到4096个点。两种细胞类型的葡萄糖示踪剂样本均显示¹³C掺入不同的官能团，其中甘油主链是标记最重的官能团。相比之下，[U-¹³C]-谷氨酰胺标记的样品仅显示主要并入脂肪酸上的体酰基链以及C2、C3位置，表明从头脂肪酸合成的主要贡献。显示的1D HSQC光谱按细胞数标准化。 图4 在[U-¹³C]-葡萄糖、[U-¹³C]-谷氨酰胺和未标记葡萄糖存在下生长的UMUC3细胞脂质提取物的1D-HSQC光谱
培养并提取UMUC3细胞，然后按照方法部分中所述制备NMR。HSQC采集参数如图3所示。 4. 用NMR估计脂质分布
除了测量不同代谢亚单位（如甘油、酰基链和胆固醇）中的¹³C掺入量外，NMR谱还提供了有关类脂分布的信息。例如，总甘油脂质池中PCs的相对数量也可以通过甘油基与胆碱甲基的比率来估计。因此，甘油共振代表所有甘油脂质，而3.21 ppm的胆碱NMe³⁺共振代表总PC水平。从未标记样品和在[U-¹³C]-Gln存在下生长的样品中，我们估计WT-PC3的PC/总GPL为55.2%±5.6%，UMUC3的PC/总GPL为39.3%±6.1%。利用¹H和HSQC光谱解析胆固醇在0.71和1.02 ppm的甲基共振（图2），我们测定了1D ¹H光谱中脂质胆碱与胆固醇的比率。对于未标记的样品，我们估计UMUC3重量的胆碱/胆固醇比率为1.85±0.24，PC3重量的胆碱/胆固醇比率为1.65 ±0.05。TOCSY光谱（图2B）也显示了其他头基团的存在，特别是乙醇胺，因此相对丰富。比较来自PE（磷脂酰乙醇胺）头基团和PC头基团的亚甲基峰的强度，发现在PC3-WT细胞中PC/PE比值为1.2。然而，我们在这些样品中没有观察到PS的显著强度，尽管在样品的质谱中观察到此类脂质，表明此类脂质的总体丰度较低。

讨论

NMR已应用于脂质组学分析，在质子谱中有一些孤立的峰，通过对标准混合物或脂质水解产物的一系列方程式操作，可以对某些类型的脂质进行定量。然而，对于粗脂肪提取物，由于脂肪结构和种类的复杂性，很少有NMR方法应用于这类研究，更不用说同位素示踪了。在这里，我们报告一个不同的观点，以应用NMR脂质组学研究。我们研究了脂质功能团的整体亚结构，并追踪了[U-¹³C]-葡萄糖或[U-¹³C]-谷氨酰胺中¹³C的掺入，而不是量化单个脂质物种。PC是哺乳动物细胞中最丰富的脂质类，在不含大量脂滴储存的细胞中含量最高，在某些癌症中也可能受到影响。我们用1D ¹HNMR、2D TOCSY和HSQC对两种癌细胞系中丰富的脂质类进行了代谢标记。根据TOCSY光谱，我们能够确定CoV<5%（标记水平>50%）的甘油亚单位中的¹³C掺入。对于较低水平的掺入，在使用HSQC光谱的情况下，酰基链的CoV估计值<10%，胆固醇甲基的CoV估计值<57%。对于未标记样品，每个地点的¹³C水平应为天然丰度水平，即1.07%。表1显示，尽管大多数峰值接近预期值，总CoV为5-10%，但仍有一些异常值，可能反映了低的总丰度和/或信号重叠时的积分。这些数值为估计2-4%的富集度设定了下限。在这两种细胞系中，甘油亚基主要是PC，它被葡萄糖而不是谷氨酰胺大量标记。相比之下，酰基链和胆固醇的标记范围要小得多，与HEK293细胞或MDA-MB-231细胞相似，但与其他一些细胞系不同。甘油亚基的高度富集表明葡萄糖通过DHAP/G3P进行大量的从头脂合成，但是相对较少的葡萄糖或Gln作用于AcCoA，因为酰基链和胆固醇的富集少了一个数量级。因为酰基链和胆固醇的富集量大约少了一个数量级。当细胞增殖并产生新的脂质时，这些细胞要么回收脂肪酸（例如从内部脂质储存中回收脂肪酸），从培养基中吸收脂肪酸，要么利用葡萄糖或Gln以外的碳源产生AcCoA。一般来说，PC占总磷脂的40%–50%，而PE约占哺乳动物细胞和亚细胞器中15%–25%。PC3野生型细胞中的PC含量对KO细胞系为55.2%±5.6%和53.8%±7.3%，而对UMUC3野生型细胞和KO细胞的富集率分别为39.2%±6.1%和49.4%±15.1%。胆固醇/GPL比值也由标记和未标记的游离胆固醇与磷脂酰胆碱的比值来估计。根据我们的计算，对于WT PC3细胞和KO PC3细胞，磷脂酰胆碱与游离胆固醇的总比率分别为1.65±0.05和1.47±0.08，而对于WT和KO UMUC-3细胞，这些比率分别为1.85±0.24和1.62±0.15。与此相比，正常饮食和高胆固醇饮食的小鼠肝脏PC/游离胆固醇比值分别为2.5-2.7和1.0-1.1。PC可由CDP-胆碱途径或PE-N-甲基转移酶（PEMT）途径产生，其中PE通过三个甲基化反应转化为PC。小鼠肝脏PC/PE比值在1.5和1.8之间维持膜完整性，而比值<1则导致膜破坏。我们通过TOCSY谱对PC和PE头基团的交叉峰进行定量分析，发现PC3-WT细胞的PC/PE比值约为1.2。我们在1D或2dnmr中均未观察到大量PS，表明这两种癌细胞中PS的丰度较低。我们还观察到PE头组标记不明显，表明葡萄糖不是这些细胞丝氨酸碳的主要来源。

结论

本文所描述的方法既提供了无需色谱分离的复杂脂质的高分辨率图谱，也概述了一种直接生成¹³C并入大块脂质分子的方法，可作为独立方法或补充基于靶向质谱的脂质组学工作流程。此外，通过HSQC检测COV<10%，检测限低至2%，提供了其他技术无法轻易产生的非常有价值的代谢信息。HSQC足以提供高标记和低标记同位素定量。TOCSY谱可用于验证峰分配、提高分辨率和¹³C掺入相对较高时的卫星峰定量（参见本研究中的甘油亚基），以及在这些条件下交叉验证HSQC分析。质子探测在²H或¹³C以上的灵敏度优势使人们能够估计¹³C富集度较低（<10%）或材料量小得多。尽管我们在这里演示了使用2D细胞培养的方法，但我们和其他人已经成功地将SIRM方法应用于各种不同的系统，包括3D球体、小鼠模型和人类受试者。通过注射或饮食引入标签很简单，组织的提取程序也很完善。从此，对细胞的分析是相同的。我们还注意到，根据本研究中使用的材料量，使用冷冻探针在每个样品约1.3小时内可以记录必要的¹H和1D HSQC光谱，这意味着在自动化条件下，每天大约可以处理20个样品，而不会破坏样品。相比之下，使用低温探针直接观察每天1-2个样本¹³C的吞吐量。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33805301/

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