科研 | Front Cell Dev Biol：牛磺酸通过ERK/RSK信号通路抑制亚牛磺酸诱导的结直肠癌进展（国人佳作）

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，以往的代谢组学研究在确定肿瘤表型的特异性小分子方面显示出巨大的潜力。在本研究中，我们通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析切除组织的代谢物，发现CRC组织中牛磺酸的浓度降低，而亚牛磺酸的浓度升高。体外实验结果表明，牛磺酸能显著抑制CRC细胞的增殖、转移和集落形成，而诱导CRC细胞凋亡。此外，牛磺酸以剂量依赖的方式调节上皮间充质转化（EMT）相关基因的表达水平。牛磺酸也减轻了亚牛磺酸诱导的CRC进展，这与ERK/RSK信号通路的抑制和细胞亚牛磺酸的减少有关。牛磺酸还可以抑制亚牛磺酸诱导的肿瘤生长和转移。CRC患者血清牛磺酸水平较低，暗示牛磺酸可能是反映CRC预后不良的一个有前景的生物标志物。总的来说，我们的研究结果表明，牛磺酸减毒，亚牛磺酸诱导的CRC进展提供了一个潜在的CRC治疗的目标。

论文ID

原名：Taurine Attenuates the Hypotaurine-Induced Progression of CRC via ERK/RSK Signaling译名：牛磺酸通过ERK/RSK信号通路抑制亚牛磺酸诱导的结直肠癌进展
期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology
IF：6.608发表时间：2021.04通讯作者：李敏，李琼
通讯作者单位：上海交通大学附属仁济医院

实验设计

实验结果

1. GC-MS测定CRC组织的代谢变化
我们用GC-MS检测CRC组织中代谢物的变化，采用世界卫生组织（WHO）IV级CRC标本（n=3），并以手术中获得的肿瘤周围正常结肠组织作为对照样品（n=3）。我们将GC-MS数据中峰值导入SIMCA（11.0版），进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）；用t1和t2分别测量两个PCs的组织提取物，得分曲线显示各组分散在不同的区域，代表癌症和非癌症样本的显著分离，表明CRC组织具有与对照组不同的特定代谢谱（图1）。 图1 结直肠癌组织的血清代谢谱与健康受试者不同(N=3组)
红圈表示癌症样本；绿色方块代表正常样本。 2. CRC组织中的牛磺酸和亚牛磺酸
在OPLS-DA模型中，我们采用可变项目重要性（VIP）来表示不同特征对样本识别的重要性。我们选择VIP值大于1的特征进行进一步考虑，包括建立判别模型和识别化学结构。我们分析并查询了以下数据库中每个特征的参数： KEGG、HMDB和Mass Bank。以肿瘤组与正常组平均标准化峰强度比的二元对数作为倍数变化，正值表示肿瘤组的平均质量反应大于正常组。我们最终确定了28种代谢物的结构，并观察到癌症组的牛磺酸含量低于正常组，而癌症组的亚牛磺酸含量高于正常组（图2）。 图2 CRC组织中牛磺酸浓度降低，而亚牛磺酸浓度升高(N=3组)
(A)描述了28个特征的VIP值。每一列显示PLS-DA模型的一个特征(图1)。误差条表示SEM。(B)癌症组与正常组间化合物水平不同(t检验，P<0.05)。y轴表示各种化合物，x轴表示代谢物水平的fold-change。 3. CRC细胞中牛磺酸降低了亚牛磺酸诱导的肿瘤进展
我们首先检测了牛磺酸作为单一药物在9个传统CRC细胞系中的作用。在2D条件下培养5天后，所有CRC细胞系的细胞活力均受到浓度依赖性抑制。HT-29和LoVo是两种具有代表性的CRC细胞系，它们在牛磺酸敏感性方面表现出显著差异，因此被选择用于后续研究（图3A）。为了确定牛磺酸是否参与CRC细胞的功能，我们采用了多种体外实验来评估牛磺酸对细胞功能的影响，包括增殖、凋亡、迁移和侵袭。图3B通过Alamar Blue分析说明牛磺酸的上调抑制HT-29和LoVo细胞的增殖（图3B），并且集落形成分析证实牛磺酸对细胞增殖具有抑制作用（图3C）。我们测定Caspase-3/7活性以研究牛磺酸对两种细胞系的凋亡作用，发现在牛磺酸处理24小时后其显著增加（图3D）。在伤口愈合迁移试验中，牛磺酸处理的细胞显示伤口愈合的悬浮液（图3E，F）；transwell分析表明，牛磺酸显著削弱了两种细胞系中的细胞侵袭（图3G，H）。为了确定升高的牛磺酸是否在亚牛磺酸诱导的CRC进展中起重要作用，我们用牛磺酸和亚牛磺酸联合治疗CRC细胞，结果显示牛磺酸挽救了对凋亡的抑制，并增强了亚牛磺酸治疗的CRC细胞的增殖、移行和侵袭（图3A-H）。 图3 牛磺酸逆转低牛磺酸对CRC进展的促进作用
(A)在连续浓度牛磺酸作用下培养5 d，用Alamar Blue法测定IC50值。(B)牛磺酸（10 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）处理后CRC细胞系的增殖率。(C)用牛磺酸（5 mM）和/或亚牛磺酸（5 mM）治疗3周后所示CRC细胞克隆形成的量化。(D)用caspase3/7报告基因检测牛磺酸（10 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）对CRC细胞的促凋亡作用。(E、F)通过伤口愈合实验评估牛磺酸（10 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）在CRC细胞中的细胞迁移效应并进行定量。(G、H)用transwell侵袭实验评估牛磺酸（10 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）对CRC细胞的侵袭作用，并进行定量分析。 4. 牛磺酸减弱亚牛磺酸诱导的CRC细胞上皮间充质转化
上皮-间充质转化（EMT）是细胞增殖、凋亡和转移的关键因素之一。我们用定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了CRC细胞EMT标记物的变化，结果显示牛磺酸处理后HT-29和LoVo细胞CDH1表达上调，Snail表达下调。与对照组相比，这些效应随着牛磺酸治疗剂量和持续时间的增加而持续（图4A-D），因此牛磺酸以剂量和时间依赖性的方式影响CDH1和Snail表达水平。我们的数据还显示，牛磺酸逆转了亚牛磺酸介导的CRC细胞中EMT标记物的表达（图4E，F）。 图4 牛磺酸逆转亚牛磺酸对CRC细胞EMT的促进作用
(A、B)采用qRT-PCR法测定牛磺酸对CRC细胞EMT相关基因表达的量效关系曲线。(C、D)采用qRT-PCR方法建立牛磺酸对CRC细胞EMT相关基因表达的时间效应曲线。(E、F)采用qRT-PCR检测牛磺酸和/或亚牛磺酸对CRC细胞EMT标志物的影响。 5. 牛磺酸通过ERK/RSK途径减弱亚牛磺酸诱导的肿瘤进展和EMT，并降低CRC细胞中亚牛磺酸水平
为了探讨牛磺酸抑制亚牛磺酸诱导的CRC细胞进展和EMT的可能机制，我们通过western blotting分析牛磺酸和/或亚牛磺酸对ERK通路的影响。牛磺酸显著抑制CRC细胞中p-ERK和p-RSK的水平，而亚牛磺酸诱导ERK活化（图5A，B），暗示ERK/RSK通路可能参与牛磺酸对亚牛磺酸诱导的CRC进展和EMT的调控。在24小时牛磺酸暴露期间，亚牛磺酸浓度以剂量依赖性的方式显著降低，而牛磺酸水平在与这些前体细胞长时间孵育期间没有增加（图5C，D）。这表明在这些细胞系中，亚牛磺酸向牛磺酸的酶促转化要么缺乏，要么受到严格调控。研究人员最近证实，在体内和体外，含黄素单加氧酶1 (FMO1)氧化了次牛磺酸，从而产生牛磺酸。因此，我们使用结肠组织进行qRT-PCR分析，发现与正常结肠组织相比，CRC中FMO1 mRNA的水平显著降低（图5E）。据报道，磷酸化激活的ERK1/2易位到细胞核，在那里磷酸化并激活丝裂原和应激激活蛋白激酶（MSK）、RSK以及信号转导和转录激活因子3（STAT3），以刺激细胞生长和增殖。为了探讨CRC细胞ERK1/2信号转导的可能下游效应者（RSK除外），我们采用LC-MS分析了三种不同ERK抑制剂对亚牛磺酸水平的影响。结果表明，只有ERK/RSK抑制剂可以调节细胞内的亚牛磺酸水平（图5F-H）。总之，ERK/RSK通路和降低的亚牛磺酸水平在牛磺酸介导的抑制肿瘤进展和EMT中起重要作用。 图5 牛磺酸可通过ERK/RSK途径逆转亚牛磺酸对肿瘤进展和EMT的促进作用，降低CRC细胞亚牛磺酸水平
(A、B)用western blotting分析牛磺酸和/或亚牛磺酸对ERK和RSK磷酸化状态的影响。(C、D) CRC细胞在指示浓度牛磺酸或亚牛磺酸的培养基中培养24小时，通过LC-MS分析鉴定细胞内牛磺酸或亚牛磺酸的浓度。(E) qRT-PCR检测正常结肠、癌旁结肠组织和CRC组织中FMO1 mRNA的表达。(F–H)在含有不同ERK抑制剂（SCH772984、Ro 318220和Stattic）的指示浓度的培养基中培养CRC细胞24小时，并通过LC-MS分析鉴定细胞内的亚牛磺酸浓度。 6. ERK/RSK信号的抑制模拟了牛磺酸对亚牛磺酸的抵消作用
先前的研究已经证实，RSK是响应ERK/MAPK信号通路激活的迁移和入侵的重要调节因子。为了进一步验证ERK/RSK信号通路是否参与了亚牛磺酸诱导的CRC进展和EMT，我们用ERK/RSK抑制剂和亚牛磺酸联合治疗CRC细胞，结果显示SCH772984抑制了细胞凋亡，促进了细胞增殖、迁移，以及亚牛磺酸处理的CRC细胞的侵袭（图6A-F和补充图7、8）。此外，我们的数据显示，SCH772984逆转了亚牛磺酸介导的CRC细胞中EMT标记物的表达（图6G，H）。总之，ERK/RSK信号的抑制模拟牛磺酸对亚牛磺酸的抵消作用。图6 一种ERK/RSK抑制剂逆转了亚牛磺酸对CRC细胞肿瘤进展和EMT的促进作用
(A) western blotting检测ERK/RSK抑制剂（SCH772984）对ERK和RSK磷酸化状态的影响。(B) SCH772984（2 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）治疗后CRC细胞系的增殖率。(C)用SCH772984（1 mM）和/或亚牛磺酸（5 mM）治疗3周后所示CRC系形成的克隆的量化。(D)用caspase3/7报告基因检测法观察SCH772984（2 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）对CRC细胞的促凋亡作用。(E)通过伤口愈合实验测定和定量分析SCH772984（2 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）对CRC细胞的细胞迁移作用。(F)通过transwell侵袭实验确定和量化SCH772984（2 mM）和/或亚牛磺酸（10 mM）对CRC细胞的侵袭作用。(G、H)采用qRT-PCR技术检测SCH772984和/或亚牛磺酸对CRC细胞EMT标志物的影响。 7. 在体内，牛磺酸可抑制亚牛磺酸诱导的肿瘤生长
我们的研究表明，牛磺酸在体外参与了亚牛磺酸诱导的CRC生长，并且牛磺酸在亚牛磺酸处理的异种移植小鼠模型中逆转肿瘤生长。HT-29和LoVo细胞在免疫功能低下的小鼠中易形成肿瘤，且潜伏期短（约14天），所以我们在裸鼠中构建肿瘤模型（约100 mm3）。在这两种模型中，单独使用亚牛磺酸会促进肿瘤生长，但联合治疗的肿瘤体积和重量较低（图7A、B、E、F）。与亚牛磺酸治疗相比，联合治疗的肿瘤显示肿瘤细胞凋亡增加（通过cleaved-caspase-3⁺区域评估）和肿瘤细胞增殖（Ki-67⁺）减少（双pan-CK⁺Ki-67⁺细胞）（图7C、D、G、H）。我们的研究结果强烈支持牛磺酸逆转亚牛磺酸诱导的肿瘤生长。 图7 牛磺酸逆转亚牛磺酸对体内肿瘤生长的促进作用
(A、B)对裸鼠皮下生长的HT-29肿瘤的肿瘤体积和最终重量进行连续测量。(C、D)代表性显微照片。（C）每200个视野中cleaved-caspase-3⁺区域和每400个视野中双CK⁺和Ki-67⁺细胞的定量。(D)HT-29肿瘤的免疫荧光治疗。每组10个肿瘤各取10张随机照片。(E、F)对裸鼠皮下生长的LoVo肿瘤的肿瘤体积和最终重量进行连续测量。(G、H)根据免疫荧光指示和测定LoVo肿瘤的典型显微照片（G）、cleaved-caspase-3⁺区域、双CK⁺和Ki-67⁺细胞（H）的定量。从每组10个肿瘤中随机采集10个显微图像。 8. 牛磺酸减弱亚牛磺酸诱导的体内肿瘤转移
由于牛磺酸被证明能减弱亚牛磺酸处理的CRC细胞的迁移和侵袭，其在体内的作用被进一步研究。因此，我们利用BALB/c小鼠自发性肺和肝转移异种移植物建立了原位CRC模型。我们通过阳性生物发光信号确认肿瘤后就开始治疗。在第25天（处死当天），我们通过生物发光信号和器官上的组织坏死斑点来确定肉眼可见的肺和肝转移，对肺、肝组织进行H&E和细胞角蛋白19染色，观察肿瘤细胞的转移情况。我们的代表性显微照片描绘了肿瘤细胞向肝和肺的转移以及肿瘤结节的形成（图8A，B）。虽然牛磺酸治疗可减少肝和肺转移结节的数量，但亚牛磺酸可促进CRC细胞转移（图8C，D），表明牛磺酸可抑制亚牛磺酸诱导的CRC向肝和肺转移。 图8 牛磺酸逆转亚牛磺酸对体内肿瘤转移的促进作用
(A)小鼠荧光素酶信号的代表性图像，显示肿瘤形成、肝和肺转移。(B)用H&E和细胞角蛋白19对小鼠盲肠、肝脏和肺进行染色。箭头表示肉眼可见的盲肠肿瘤和转移点。(C、D)肝/肺转移区域的定量结果。 9. 血清中低水平牛磺酸与CRC患者预后不良相关
为了探讨牛磺酸是否可以作为CRC患者的一个潜在的预后生物标志物，我们用LC-MS测定了健康献血者和CRC患者的血清牛磺酸水平。值得注意的是，当其他临床病理因素得到控制时（补充表1），我们发现转移性CRC患者的血清牛磺酸浓度明显低于原发性CRC患者（图9）。这些结果表明，血清中低水平牛磺酸与CRC患者预后不良相关。图9 血清中牛磺酸水平的下调与CRC患者预后不良相关

讨论

本研究的目的是确定CRC的异常代谢途径及其对肿瘤进展的影响。使用GC-MS，我们鉴定了28种代谢物，并且发现癌症组与正常组相比牛磺酸水平较低，亚牛磺酸水平较高。然而，牛磺酸和亚牛磺酸的生物学作用仍然是难以捉摸的。牛磺酸的生物合成包括半胱氨酸双加氧酶催化半胱氨酸氧化为半胱氨酸亚磺酸，半胱氨酸亚硫酸脱羧酶催化脱羧，以及亚牛磺酸脱氢酶催化亚牛磺酸氧化为牛磺酸。在我们的研究中，牛磺酸和亚牛磺酸可能在CRC的发病机制中起着关键作用。尽管在早期诊断、外科技术和化疗方面取得了可喜的进展，但CRC患者的预后仍然令人失望。由于代谢组学异常与肿瘤进展有关，阐明新的CRC相关的代谢组学标志物对于CRC的早期诊断和晚期有效治疗具有重要意义。许多研究表明，牛磺酸的抗肿瘤作用与其促进细胞凋亡和减少细胞增殖的能力有关。Gao等人报道了亚牛磺酸对胶质瘤细胞增殖和侵袭性的增强作用。在我们的研究中，我们用一组CRC细胞系检测单一药物牛磺酸，在2D条件下培养5天，我们观察到所有细胞系的细胞活力都受到浓度依赖性的抑制。我们选择HT-29和LoVo作为研究对象，探讨其对牛磺酸敏感性的差异，并进行一系列实验，探讨牛磺酸对CRC发生发展的影响。牛磺酸诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，迁移和侵袭能力。我们评估了CDH1和Snail蛋白作为EMT的重要标志物，因为EMT主要参与细胞增殖、凋亡和转移。我们发现，牛磺酸治疗促进CDH1水平，而抑制Snail水平，这表明牛磺酸影响CRC细胞的转移、凋亡和参与EMT的增殖。我们假设我们的结果将有助于更好地理解牛磺酸作为CRC病理生理介质的作用，并且结果表明牛磺酸可以减弱亚牛磺酸诱发的恶性表型。牛磺酸对CRC的抑制作用暗示牛磺酸治疗可能是阻止CRC进展的一种有前景的方法。牛磺酸介导的CRC EMT抑制机制目前尚不清楚。ERK信号通路中的蛋白在各种形式的癌症（包括CRC）中表现出过度活跃和过度表达，并且ERK信号通路被认为调节EMT、肿瘤细胞迁移、侵袭和细胞周期进程。由于ERK的特殊结构特性、作用机制、反馈以及催化的各种底物，ERK1/2是一种潜在的用于抑制肿瘤进展的策略。然而，ERK信号分子作为治疗靶点的发展仍然具有挑战性，因为这些新化合物的脱靶和毒性的可能性也增加了。然而，值得注意的是，牛磺酸作为一种天然氨基酸可以克服这些问题。体外实验结果表明，牛磺酸处理后磷酸化ERK1/2和RSK的表达呈剂量依赖性降低，随着亚牛磺酸浓度的增加，ERK1/2和RSK的磷酸化也相应增加。这种剂量依赖性活性可能是牛磺酸和亚牛磺酸对CRC细胞产生相反作用的主要机制。此外，我们的实验显示，牛磺酸抑制CRC细胞肿瘤进展的代谢途径异常。牛磺酸降低了细胞内的亚牛磺酸水平，表明细胞外牛磺酸的可用性可能会减少从头合成的亚牛磺酸。先前的证据表明胶质瘤组织中牛磺酸水平降低，我们发现牛磺酸水平的改变，改变了细胞亚牛磺酸水平。在这些细胞系中，要么亚牛磺酸转化为牛磺酸的酶缺乏，要么转化受到严格调控；这种抑制作用可能参与了降低亚牛磺酸水平的机制。我们假设，细胞亚牛磺酸水平的变化会反映在对肿瘤代谢物的影响中，这一点得到了我们关于亚牛磺酸对细胞侵袭、增殖和凋亡作用研究结果的支持。我们还推测牛磺酸的抑制作用是通过EMT介导ERK/RSK级联反应和牛磺酸对亚牛磺酸的竞争性抑制来实现的。牛磺酸可抑制HT-29和LoVo异种移植瘤的生长，为进一步合理治疗CRCs奠定基础。此外，牛磺酸在体内可增加细胞凋亡，减少细胞增殖。我们在此也证明牛磺酸能在体内外抑制细胞迁移、侵袭和转移。我们将CT26细胞原位移植到牛磺酸处理的小鼠体内不会产生肝或肺转移，转移结节的数量和生物发光信号的表达支持了这一点。因此，牛磺酸治疗可以预防EMT，抑制CRC细胞的转移。代谢组学因其与表型的密切关系和对多种因素的敏感性而被广泛应用于生物标志物的发现。作为基因组学、转录组学和蛋白质组学的下游类型，代谢组学已被用于检测反映生物状态变化的各种细微修饰，即使相应的基因和蛋白质没有可测量的变化。因此，潜在生物标志物的候选物更有可能通过代谢组学获得。相比之下，内源性代谢物的数量少于基因、转录物和蛋白质，具有相同的基本化学结构，并且极为保守，使得分析代谢结果更为简单。此外，代谢组学可用于生物样品的非侵入性评估，并可更容易地转化为临床实践。这些由癌症驱动的代谢异常可能代表了肿瘤的固有特征，甚至可以预测癌症的发病机制，提供与系统表型生物学相关的血清代谢物的变化。因此，血清代谢物的变化可能揭示独特的病理状况，并提供早期诊断和预后。我们的结果表明，血清牛磺酸可用于区分CRC患者和健康对照组，并且在CRC中观察到低水平的牛磺酸水平与肺和肝转移相关。我们的多变量分析也表明低水平的牛磺酸可能是CRC进展的独立危险因素。总之，我们证明了亚牛磺酸参与CRC的进展，牛磺酸减弱了这一趋势。牛磺酸对CRC进展的抑制作用可能通过EMT介导ERK/RSK级联，以及牛磺酸对亚牛磺酸的竞争抑制。结果表明，牛磺酸可能是治疗CRC的一种有前途的药物。我们的研究结果也为代谢、信号转导和肿瘤病理生理之间的相互作用提供了证据。牛磺酸能减轻亚牛磺酸诱导的肿瘤侵袭和增殖，为早期诊断和治疗提供了一个有希望的靶点。然而，有必要进一步研究牛磺酸的作用，为CRC治疗提供一种潜在的工具。

原文链接：  

https://doi.org/10.3389/fcell.2021.631163

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