科研 | 中国农业科学院: 花青素和共色素黄酮是茶叶中紫色的主要来源(国人佳作）

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编译：微科盟北越城主，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读具有紫色的茶品种引起了全球的关注。为了更好地了解紫色来源的主要化学成分，我们应用广泛靶标代谢组学对冻干紫色茶叶(PTLs)和绿色茶叶(GTL)的色素黄酮进行了研究，共鉴定出33种花青素，其中飞燕草色素3-O-半乳糖苷和花青素3-O-半乳糖苷含量最高。接着我们鉴定出226种其他化学成分，包括193个黄酮类化合物和33个单宁酸，其中PTLs和GTL在甲基化、酰化和糖基化黄酮类化合物差异显著。此外，花青素、类黄酮、叶绿素和儿茶素的平均含量也存在显著差异(p < 0.01)。4种PTL被发现含有高丰度的(-)表没食子儿茶素-3-(3 "-O-甲基)没食子酸酯(>10 mg/g)。这些结果表明，结构修饰的花青素和共色素黄酮是茶叶紫色来源的主要化学成分。

论文ID

原名：Insight into the pigmented anthocyanins and the major potential co-pigmented flavonoids in purple-coloured leaf teas译名：花青素和共色素黄酮是茶叶中紫色的主要来源
期刊：Food Chemistry
IF：7.514发表时间：2021.06通讯作者：吕海鹏
通讯作者单位：中国农业科学院茶叶研究所

实验设计

实验结果

1.PTLs中主要有色花青素的分析
茶是全球最受欢迎的非酒精饮料。它通常由两种广泛栽培的茶树，Camellia sinensis var sinensis（中国型）和 Camellia. sinensis var. assamica（阿萨姆类型）。除了最常见的绿叶茶品种外，研究者在山茶科中一直发现有紫色芽的品种。由具有明显紫色芽的品种生产的茶产品被确定与花青素的积累密切相关。例如，研究者在具有明显紫色叶子的新茶品种“紫烟”中观察到叶色与花青素色素含量之间存在显着相关性。如图 1A 所示，PTL 中花青素的总含量范围为 19.48 ± 1.28 mg 100 g^-1(P-4) 至 42.58 ± 1.48 mg 100 g^-1 (P-2)，平均值为 27.21 ± 7.47 mg 100 g^-1。这比 GTL 的平均花青素含量高出 16.6 倍以上。迄今为止，我们仅在茶中鉴定出少量花青素。为了深入了解 PTL 中的花青素成分，我们对新鲜茶叶的甲醇提取物进行了靶向代谢组学研究，共鉴定出花青素33种，包括花青素4种、飞燕草甙5种、锦葵甙3种、天竺葵甙5种、芍药甙3种、矮牵牛甙4种、原花青素6种、花青素其他3种。统计分析清楚地表明9个 PTL存在于同一簇中，而3个GTL存在于单独的簇中（图 1B），HCA 结果证实了 PTL 中积累的花青素（图 1C）。然而，9个专利文献中鉴定出的花青素的相对含量差异很大。在 PTL 中鉴定出的花青素中，del-3-O-gal 和 cya-3-O-gal 含量最高。同时，del-3-O-(6-O-丙二酰)-glu、pet-3,5-O-diglu、cya-3-O-(6-O-丙二酰)-glu和pel-3-O -(6-O-丙二酰)-glu的含量最低。综上，我们发现原花青素 A1 和 A2 是 PTL 中的主要原花青素。据报道，糖基化和随后的酰化在增加含羟基黄酮类化合物的溶解度和稳定性方面起着至关重要的作用，具体作用机制是通过糖残基的外部氢键相互作用形成的；同时这也会导致植物器官的颜色改变。在鉴定的 33 种花青素中，我们发现花青素、飞燕草素、锦葵素、天竺葵素、芍药苷和矮牵牛花素以 3-O糖苷键形式存在，这与之前的报告一致。茶叶中存在的花青素苷结构稳定，在紫茶叶着色中起重要作用。在这项研究中，我们发现PTLs在花青素、mal-3-O-gal、peo-3-O-gal、pet-3-O-gal 和 pet-3-O-ara 的含量水平比 GTLs分别高约为 196、79、51 和 48 倍（图 1C）。此外，飞燕草素3,5-O-2-葡萄糖苷和矮牵牛花素 3,5-二葡萄糖苷的检测表明，可能发生了单糖苷（花青素 3-O-葡萄糖基转移酶占优势）的第二步糖基化（花青素 5-O-葡萄糖基转移酶占优势）；这在其他植物中已有报道。PTL中鉴定的主要花青素的化学结构如图1D所示。除了上面讨论的修饰之外，甲基化在花青素中也有报道，包括通过O-甲基转移酶或C-甲基转移酶和脂肪族酰化 (乙酰化和丙二酰化)。例如，芍药苷和锦葵素分别是单和二甲基化的花青素。值得注意的是，我们在 PTL 中检测到高水平的这些化合物（图 1C）。乙酰化成分，例如天竺葵素 3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)、花青素 3-O-(6-Omalonylbeta-D-葡萄糖苷) 和飞燕草素 3-O-(6''-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷也被鉴定。在本研究中对这些O-甲基化和乙酰化花青素的鉴定使我们能够扩展已知存在于紫茶叶中的化合物库。图1 紫叶茶（PTLs）中花青素总含量及花青素成分多元统计分析
(A) PTLs中花青素（TAs）的总含量；(B)主成分分析（PCA）；(C) 样品中鉴定出的33 种花青素的热图；(D) PTL中鉴定的主要花青素的化学结构。 2.  PTLs和GTLs中潜在共色素成分的表征
虽然花青素被认为是主要的色素，但之前的研究表明，许多其他成分，尤其是黄酮类、酚酸和单宁，可能作为辅助色素有助于植物着色。类黄酮通常占干茶叶的 2-3%，主要是因为它们具有独特的味道、颜色和多种健康益处。此外，在其他植物物种中进行的各种研究表明，类黄酮（黄酮、黄烷醇和异黄酮）及其糖苷对共色素沉着有显着贡献。在这项研究中，我们发现 G-1 品种的绿茶样品具有最高的类黄酮含量，而与9个PTL相比，我们发现 G-2和G-3的类黄酮含量非常低（图 2A）。尽管在本研究中观察到 PTL (2.04%±0.14%) 和 GTL (1.58%±0.46%) 的平均 TFs (p < 0.01) 存在明显差异，但这应该通过分析大量的 GTL 样本。此外，还进行了基于MS的代谢组学分析，以深入了解PTL和GTL中存在的类黄酮的总体差异。我们共鉴定出 226 种代谢物，包括193种黄酮类化合物和33种单宁。它们进一步分为类黄酮 (107)、黄酮苷，包括 O-糖苷 (64) 和 C-糖苷 (22)，以及单宁 (33)。存在于植物中的各种黄酮类化合物及其相应的糖苷是重要的天然辅助色素因子，它们对大多数花、果实、种子和叶子的颜色有贡献。有趣的是，本研究鉴定了以葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖为主要糖配体的各种黄酮苷；这大大增加了在 PTL 中检测到的黄酮类化合物及其糖苷的数量。芹菜素、槲皮素、山奈酚、杨梅素和木犀草素是茶中存在的五种主要黄酮醇。许多O-或C-糖苷结合的黄酮醇（图 2B）通过与市售标准品的MS/MS数据和黄酮苷元及其糖苷的碎片方式来鉴定。我们发现以游离形式检测到的黄酮类化合物数量有限；然而，糖基化会显着影响它们的溶解性、稳定性和生物活性。据报道，糖基化在它们的运输、分隔和储存中也起着至关重要的作用。根据代谢物特征，我们在包含三个组分（31.0%、22.1% 和 13.1%）的PCA 评分图中观察到9个PTL和3个GTL 之间存在显着差异（图 3A）。基于 OPLS-DA 结果，我们筛选出35个VIP > 1 的组分。在查看热图（图 3B）时，差异变得更加明显，其中 35 个组分被分为两个组。很明显，I组中的14种黄酮和4种单宁在GTL中的含量较高，而II组中的17种黄酮在PTL中的含量较高。一些糖苷类黄酮，如芹菜素-8-C-(2''-木糖基)-葡萄糖苷和木犀草素-6-鼠李糖-7-O-葡萄糖苷在两组中的丰度相似（P-1、P-2和P-9 除外），这可能导致难以区分 PCA。我们选择了在 PTL 和 GTL 之间表现出最高倍数变化的类黄酮和单宁，如图 3C 中所列。其中，异鼠李黄素-3-O-新橘皮糖苷（6.92倍）、异鼠李素（6.87倍）、柽柳黄素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（6.55倍）、芹黄素-7-O-(6''-p-香豆醇) 葡糖苷(5.36倍), 芹黄素-7-O-芸香糖苷(5.32倍), quercetin-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside(5.31倍) 、槲皮素-3-O-新橙皮苷（3.52 倍）和槲皮素-3-O-（2'' -Galloyl）阿拉伯糖苷（3.25倍）在 PTL 中的浓度高于 GTL。相比之下，GTL 中的浓度高于 PTL，包括鞣花酸（5.22 倍）、茶黄酸 B（3.75 倍）、山奈酚（2.94 倍）、(+)-afzelechin3-O-没食子酸酯（2.52 倍）、没食子酸甲酯（2.16 倍）、山奈酚 -3O-(2'' -galloyl) 半乳糖苷 (2.13倍)、表阿夫儿茶精(2.09倍) 和槲皮素-3-O-(2'' -O-鼠李糖) 芸香糖苷(2.03倍)。正如之前报道的那样，自然界中黄酮苷的产量有限，限制了它们的鉴定和对其多样化生物活性的探索。在这项研究中，我们对193种黄酮类化合物和33种单宁的鉴定将大大有助于扩展我们对紫茶共色素黄酮成分的了解。图2 紫叶色茶和绿叶色茶中总黄酮含量及黄酮类成分的多元统计分析
(A) 9个PTL和3个GTL中总黄酮含量；(B)五种主要黄酮醇及其糖苷存在于茶中(红色的化合物在PTL中含量更高，绿色的化合物在GTL中含量更高)。
图3 紫色茶和绿色茶中黄酮类化合物和单宁的多元统计分析
(A)主成分分析(PCA)；(B)样品中黄酮类化合物(VIP > 1)的热图；(C) PTL中已鉴定的类黄酮和单宁水平> 5或< -1的变化。 3.  PTLs和GTLs儿茶素和叶绿素含量的变化
儿茶素是茶叶的主要成分，含量占超过一半的茶多酚 (20–30%) 。如表1所示，PTLs中儿茶素（TC）的总含量一般>220 mg/g（P-3中的161.9 mg/g除外），GTLs中的总儿茶素（TC）含量显着降低。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）所占比例最大（从 P-2 的 92.4 mg/g 到 P9 的 165.4 mg/g），并且在 PTL 和 GTL 中表现出显着差异（p＜0.01）。我们发现所有评估的 GTL 具有较低的 EGCG 含量（平均：81.9 mg/g），也发现表没食子儿茶素 (EGC)、表儿茶素没食子酸酯 (ECG) 和表儿茶素 (EC) 在 PTL 中的含量较高。同时，没食子儿茶素 (GC) 的含量最少。总体而言，除了表没食子儿茶素 (EGC) 外，所有儿茶素成分都以较高水平存在于PTL中。值得注意的是，四个 PTL 样品被发现富含 (-)-表焙儿茶素-3-(3'' -O-甲基) 没食子酸(EGCG3''Me)，其中在 P-2、P-4、P-5 和 P-6中的含量约为 10 mg/g（表 1）。据报道，EGCG3''Me而不是 EGCG表现出更有效的抗过敏活性、更高的生物利用度、更高的稳定性和近9倍的吸收率，因此引起了很多关注。因此，我们推测 EGCG3''Me 可能在一些紫色叶茶品种中发生过度积累。 表1 紫色茶叶(PTLs)和绿色茶叶(GTLs)中主要儿茶素的浓度注：GC，儿茶素；EGC，表没食子儿茶素；C，儿茶酸；EGCG，表没食子儿茶素没食子酸酯；EG，表儿茶酸；GCG，儿茶素没食子酸盐；ECG，表儿茶素没食子酸盐；CG，儿茶素没食子酸盐；EGCG3“Me，(-)-表没食子儿茶素-3-(3”-O-甲基)没食子酸酯；TCs，儿茶素总量。一列数据后的不同字母代表在95%概率水平上的显著差异。值以平均值±标准差(mg/g)表示。 我们在所有茶叶样品中观察到叶绿素a和b的含量存在显着差异（p < 0.05）（图 4）。平均而言，9个PTL（平均：2.33 ± 0.59 mg/g）的总叶绿素含量几乎是3个 GTL（平均：1.24 ± 0.80 mg/g）的两倍。以前研究者认为，具有绿色叶子的茶树通常比具有其他颜色叶子的茶树具有更高的叶绿素含量。然而，本研究发现PTLs的叶绿素含量远高于GTLs。此前，“C”作为典型的紫芽茶品种被广泛研究，其叶绿素含量低于普通绿茶品种。我们的结果同意这个结论；然而，我们发现其他 PTL 具有非常高的叶绿素含量。先前报道的一种可能机制表明，负责降解叶绿素的叶绿素酶 1 (CLH1) 在“紫娟”中活跃，导致了肉桂酸4-羟化酶(C4H)和二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)的选择性剪接，从而降低光合作用水平。图4 研究了紫色茶叶和绿色茶叶中叶绿素a和叶绿素b的含量
注：Chla，叶绿素a；Chlb，叶绿素b。 4.    花青素积累及其侧链修饰对紫色着色的影响
侧链改变已被证实显着影响类黄酮的功能，包括它们的颜色、稳定性和生物利用度。糖基化和甲基化是两个关键过程。在本研究中，我们鉴定了各种甲基化和糖基化的黄酮类化合物，这些化合物的含量和组成在PTL和GTL之间存在显着差异。为了进一步分析这些差异，我们将这些关键的黄酮类化合物整合到简化的代谢途径图中（图 5）。如图5所示，二氢山奈酚、槲皮素和杨梅素首先转化为花色素类，主要包括天竺葵素、花青素和飞燕草素。接下来，这三种花青素被糖基化和甲基化，在 PTL 中积累。糖基化是提高花青素稳定性的关键策略，以允许花青素在PTL中的超堆积作用。最近的一项研究报告说，紫叶“紫娟”茶中的几种关键的葡萄糖基转移酶 (GT) 和转录本显着上调。之前已经证实糖基化程度也在着色中起作用，例如，在给定的 pH 值下，花青素 3-O-糖苷（单糖苷）比花青素 3,5-糖苷（二糖苷）更容易着色。通常，花青素3-O-糖基转移酶被认为是参与花青素单糖基化，因此PLT中花青素3-O-糖苷的积累可能是染色的化学基础。通常，芳香酰化包括添加香豆素基或芥子油基来稳定和加强花青素的蓝色调。根据以往的研究，脂肪酰化(通常是丙二酰化)对于化合物的水溶性、稳定性和抗酶降解性非常重要。甲基化是另一个重要的修饰。在这项研究中，我们发现各种黄酮类化合物，尤其是花青素被甲基化。Peonidin（花青素在其 3' 羟基上被甲基化）、矮牵牛花素（在其 3' 羟基上被甲基化）和锦葵素（在其 3' 和 5' 羟基上都被甲基化）被发现在 PTL 中积累。虽然我们没有进行分子水平的实验，但我们可以推测花青素O-甲基转移酶在 PTL 中可能比GTL 中更活跃；这与之前的研究结果一致，花青素与许多其他苯丙素的来源相同。先前有报道称，咖啡酰辅酶 A-O 甲基转移酶可下调矮牵牛花色苷生物合成的激活，同时上调挥发性苯丙烷类物质的产生。基于平衡茶叶风味品质和营养品质（花青素）的需要，有必要进一步研究控制这些化合物水平的代谢通量。此外，儿茶素也可以发生甲基化，导致 PTL 中 EGCG3''Me 的含量更高。图5 茶叶呈紫色的预测机制：花青素与共色素黄酮类化合物的潜在相互作用
注:C4H，肉桂酸4-羟化酶；4 cl, 4-coumarate-CoA连接酶；DFR, dihydroflavonol 4-eductase；CHS，查耳酮合酶；F3’H，类黄酮3’-羟化酶；F3 ' 5 ' H，类黄酮3 ' 5 ' -羟化酶；ANS，花青素合成酶；ANR，花青素还原酶；FLS，的黄酮醇合成酶；LAR，leuacoanthocyanidin还原；MTs，甲基转移酶；GTs，葡糖基转移酶。 5. 潜在共着色黄酮类化合物在紫色着色中的补充作用
花青素是一类对色素沉着至关重要的黄酮类化合物，尤其是在茶叶中；然而，它们的稳定性相对较低，并且容易因温度、光、pH、溶剂和氧气而降解。花青素在制茶过程中不易保存，这涉及极端温度（例如绿茶脱酶过程的温度一般＞200℃）和活性酶催化（例如，许多酶在加工过程中非常活跃），例如红茶的萎凋、揉捻和发酵）。共着色通常由黄酮、黄酮醇和糖苷引发，是稳定花青素有色结构形式并因此增强最终着色的有效策略。据报道，花青素分子与其他无色有机成分（共色素）之间的疏水相互作用形成分子缔合并稳定其最终颜色外观。在这项研究中，我们在 PTL 中检测到较高水平的黄酮糖苷，以及超堆积作用的花青素，特别是芹菜苷、槲皮素糖苷（图 2B）和花青素。先前的研究表明，花青素-3-O-葡萄糖苷、芍药苷-3-O-葡萄糖苷、飞燕草苷-3-O-葡萄糖苷、petunidin-3-O-葡萄糖苷、malvidin-3-O-葡萄糖苷与共色素黄酮(芹菜素、山奈酚、槲皮素、杨梅素等)、儿茶素和一些酚酸(没食子酸、咖啡酸等)相互作用，改变了它们的着色能力。特殊茶品种的最终紫色外观可归因于多种因素的组合，包括花青素结构、包裹着花青素液泡周围的pH值以及作为共色素存在的黄酮类化合物。花青素与共色素黄酮醇和糖苷之间的相互作用被认为有助于茶的紫色着色。研究者有必要进一步研究色素（花青素）和辅助色素（黄酮醇和糖苷）之间的分子间相互作用，以便更深入地了解某些茶的神秘紫色。最近，对紫色茶叶化学成分的研究取得了显着进展；紫叶茶的一些独特成分已通过植物化学研究被分离和鉴定。在这项研究中，我们尝试使用基于广泛靶向代谢组学的有效且可行的方法来鉴定主要的色素类黄酮（花青素）并探索 PTL 中潜在的色素类黄酮复合物。这种方法提供了鉴定 PTL 样品中多种代谢物的能力。深入了解导致PTLs独特颜色的关键化合物，包括花青素、黄酮类和叶绿素，可以为理解茶叶的紫色提供理论基础，并有助于开发具有健康益处的新型茶产品。本研究中进行的大多数分析都使用甲醇提取物作为样品；然而，从健康益处的角度和为了比较的目的，了解干茶中活性化合物的数量和种类叶子是必需的。此外，为了准确反映这些紫茶产品的潜在健康影响，有必要在未来的研究中确定茶浸液（通过热水提取制备）中的活性化合物。我们应用了广泛靶向的代谢组学策略，使用由 MetWare Biotechnology Co., Ltd.创建的自编译数据库（中国武汉），收集了黄酮类标准品的 MRM 信息，以鉴定茶叶中存在的黄酮类化合物及其苷类。我们搜索数据库以确认一些具有标准信息的黄酮类化合物的结构，并确认类黄酮苷元及其糖苷的碎片模式。MRM 的比较使我们能够鉴定与不同糖单位、甲基和酰基结合的黄酮类化合物。然而，最终确认结构身份的最佳方法仍然需要化学标准物质。

结论

黄酮类化合物是茶叶呈现紫色的重要来源。从紫色茶品种获得的新鲜茶叶富含次生代谢物，尤其是类黄酮。与 GTL 相比，PTL 含有更高水平的类黄酮（特别是花青素）、儿茶素和叶绿素。我们在紫色茶品种中发现EGCG3''Me的超堆积作用。此外，我们鉴定出 33 种花青素、193 种黄酮和 33 种单宁，并且所有花青素在 PTL 中都表现出超堆积作用。我们还鉴定了芹菜素、槲皮素、山奈酚、杨梅素及其相应糖苷的苷元，在 PTL 和 GTL 之间观察到它们的含量存在显着差异。总之，在 PTL 中过度积累的各种结构修饰的花青素是导致叶片着色的主要化学成分之一。然而，花青素和其他导致紫色的黄酮类化合物之间相互作用的机制值得进一步研究。这些结果可为理解紫茶中存在的主要（共）色素黄酮类化合物提供重要的理论基础，并有助于科学阐明影响紫茶颜色和质量的化学物质基础。

原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S030881462101284X?via%3Dihub

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