科研 | Nano Impact: 代谢组学揭示纳米零价铁胁迫下玉米代谢物和矿物质的剂量依赖性变化

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编译：微科盟一，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

纳米零价铁（nZVI）在环境领域广泛用于降解有机污染物，但对作物造成的潜在风险尚不清楚，而这对于纳米零价铁的后续应用至关重要。该研究中，研究者在混合了0、50和500 mg/kg nZVI的田间土壤中种植玉米四周，发现500 mg/kg nZVI胁迫下，由根吸收并转运到叶的Fe比对照组增加了36%；50 mg/kg nZVI处理组中，根系伸长增长了150-200%；500 mg/kg nZVI浓度下，叶片中的色素、脂质过氧化和多酚类水平分别增加了12%、87%和23%，而Al、Ca和P的累积量分别降低了62.2%、19.7%和13.3%。玉米根系代谢组学分析揭示了抗氧化和胁迫信号相关代谢物在50 mg/kg nZVI胁迫下有所下调，在500 mg/kg nZVI胁迫下有所上调，50 mg/kg nZVI处理组中，谷氨酸含量增加了11倍，谷氨酰胺下降了99%。50 mg/kg nZVI胁迫下有8条代谢通路受到干扰，而500mg/kg nZVI处理组却没有，这一现象表明低剂量胁迫造成的代谢紊乱对植物的健康造成了潜在风险。总之，代谢组学分析加深了研究者在分子水平上植物对nZVI胁迫的响应的相关认识，同时为食品安全评价方面全面表征作物面临的风险提供了有力工具。

论文ID

原名：Metabolomic analysis reveals dose-dependent alteration of maize (Zea mays L.) metabolites and mineral nutrient profiles upon exposure to zerovalent iron nanoparticles译名：代谢组学揭示纳米零价铁胁迫下玉米代谢物和矿物质的剂量依赖性变化
期刊：NanoImpact
IF：5.316发表时间：2021.06通讯作者：赵丽娟，Gardea-Torresdey
通讯作者单位：南京大学，德克萨斯大学埃尔帕索分校

实验设计

实验结果

1. Fe在玉米根系和叶片中的吸收和转运
在玉米根和叶中Fe的吸收和转运都表现出浓度依赖性，图1显示50 mg/kg nZVI处理并未造成Fe的显著增加，而500 mg/kg nZVI处理中Fe向叶的转运与对照相比显著增加了35.9%。由于nZVI具有轻微负电位，这些纳米材料很容易在土壤中聚集成大粒径颗粒，这有可能是50 mg/kg nZVI处理下植物组织中没有积累较多Fe的原因。高剂量处理下玉米组织中积聚了较多的Fe，可能是由于Fe⁰ NPs中释放出了Fe²⁺/Fe³⁺。Fe⁰的高化学活性使其在水体和土壤中具有一定的反应性和不稳定性，土壤中可能会发生一系列有机质或微生物主导的氧化还原反应。总之，Fe²⁺/Fe³⁺的释放增加了土壤中Fe的生物有效性，暗示了Fe在植物中积累可能主要与粒径大小、Fe转运蛋白和特异的防御响应有关，但还需更多研究来加深对该机制的理解。图1 玉米根和叶中的Fe吸收
玉米分别在0、50和500 mg/kg nZVI的土壤中种植四周。数值用平均值±SD来表示，不同字母表示有显著差异（p≤0.05, n=4），使用one-way ANOVA进行分析，并进行Tukey-Honestly显著性差异多重比较检验。 2. 玉米对Fe NPs和糖含量的生理响应
与对照相比，无论nZVI暴露浓度是多少，植物株高、叶和根鲜重均未受到影响。50 mg/kg nZVI处理比对照组显著增加了49.8%的根长，有研究报道拟南芥暴露于0.5 g/L的nZVI后，其根长显著增加，对其机制进行研究发现这主要是nZVI介导下羟基自由基引起的细胞壁松弛。然而，由于该研究中胁迫的剂量依赖性，在500 mg/kg nZVI处理下根系并未发生明显改变，有相似的研究报道水培条件下低浓度nZVI增强了香蒲生长，高浓度zNVI却造成了毒性效应，zNVI依附在根表面并形成根铁斑，阻止了根系吸收水分。在该研究中，土培条件可以缓解一部分zNVI对根表的直接作用，减少了明显的植物毒性效应，但仍然对根系生长造成了一些影响，也正是因为500 mg/kg处理下nZVI在土壤中的聚集，减少了对植物的伤害。将来研究者还需对自然土壤条件下nZVI的分布和粒径进行详细评估，尽管相关的分析技术还不成熟。nZVI暴露并未对根和叶的总糖、非还原糖、淀粉含量造成影响。植物中的糖含量是碳和能量状态的主要指标，与植物生物量有很好的关联性，同时，在非生物胁迫中糖也会调控与植物生长防御相关的基因表达。100-200 mg/L的nZVI处理水稻籽苗造成较高的可溶性糖水平；用150、300、600 mg/kg CuO处理白菜导致叶片总糖含量上升。因此，该研究结果中胁迫下糖类的调控模式与前人报道相似。 3. 叶绿素生物合成和光合作用活性受到的影响
叶绿素含量反应了植物光合作用时利用光能并产生有机质的能力，在叶片中，500 mg/kg nZVI显著增加了叶绿素a和类胡萝卜素含量，而光系统Ⅱ效率（Phi2）和线性电子流（LEF）未受影响；其中，叶绿素a浓度从0.402 mg/kg（对照）增加至0.449 mg/kg（nZVI），类胡萝卜素从0.069 mg/kg（对照）增至0.079 mg/kg（nZVI）（图2A）。因此，高剂量zNVI添加至土壤可以通过增加叶片中的铁含量促进叶绿素生物合成，但却并不影响总体光合作用活性。这一结果与植物元素分析的结果一致，即仅在高剂量处理组中检测到Fe含量的增加。与该研究相似，水稻种子预先用不同浓度nZVI处理后种植14天，被发现叶片光合色素含量呈现剂量依赖性增加，最大至20 mg/L。图2 nZVI处理（0、50和500 mg/kg）土培四周后玉米叶片的（A）光合色素含量（mg/g），（B）LEF，（C）Phi2。标注同图1。
 4. 脂质过氧化和多酚含量
尽管Fe是植物生长的关键元素，但其强反应性也会带来毒性。MDA是磷脂质分解后的主要醛类，可用于细胞膜完整性评估的主要指标，在根中，50 mg/kg nZVI对MDA生成没有影响，而500 mg/kg nZVI处理中，MDA含量比对照组增加了86.5%（图3A，B），这表明胁迫导致了剂量依赖性的氧化损伤。脂质过氧化程度与细胞膜损伤和活性氧（ROS）产生直接相关，该研究暗示50 mg/kg nZVI并未引起ROS生成，因此植物的解毒途径足以缓解胁迫症状。酚类化合物在作物可食部质量评估上占据重要作用，且具有强抗氧化活性，能够通过清除各种活性氧自由基来促进植物健康生长。与对照相比，玉米叶片中多酚含量在50 mg/kg nZVI下未受影响，但在500 mg/kg nZVI下增长了22.9%（图3C，D），这一结果表明高剂量nZVI胁迫下植物受到了氧化胁迫。总之，500 mg/kg nZVI处理引起了脂质过氧化和增多的多酚含量，但也增强了根系伸长、叶绿素含量和Fe累积，为更好的理解这些看似矛盾的理化数据，还需进一步的代谢组学表征去揭示这些生理生化响应的潜在机制。图3 nZVI处理（0、50和500 mg/kg）土培四周后玉米叶片（A），根（B）的MDA含量，以及叶片（C）和根（D）中的多酚含量。标注同图1。
 5. 玉米根系和叶片中的营养元素累积
研究人员对玉米根和叶中营养元素（B, Cu, Fe, Mn, Mo, Se, Zn,  Ca, K,  Na,  Mg,  N,  P, S,  和Al）进行了评估并将结果在表1中展示。500 mg/kg nZVI下，与对照相比，玉米叶片中显著累积了更少的Al（62.2%）、Ca（19.7%）、P（13.3%），而根中Al含量却显著增加了64.2%（低剂量）和100.41%（高剂量），Al的根系吸收量增多，但叶片的转运量却减少的具体机制未知。Ca在细胞壁形成和稳定、膜结构的维持、特异酶类（磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）的活化，以及对一系列刺激的细胞响应调节中至关重要。P是核酸、磷脂、三磷酸腺苷的关键组分，据报道，500 mg/kg nZVI处理土壤后拟南芥茎中的P含量增加，表明其含量具有植物种类依赖性，该研究中500 mg/kg nZVI下Ca和P含量显著减少的机制未知。然而，考虑到明显的毒性效应，该结果暗示还有潜在的风险被低估，急需更详细的代谢组学分析来证实。表1 玉米叶和根的营养元素含量（mg/kg干重） 6. zNVI改变玉米根的代谢物表征
由于根系直接暴露在nZVI中，是吸收水和养分的主要器官，因此研究者对根系进行代谢组分析，结果鉴定和半定量到191种代谢物。PLS-DA分析揭示了在组分1中，对照组和高剂量组均与低剂量组分离，解释了总差异的22%（图4），这表明nZVI低剂量处理引起了更显著的代谢物变化。高低剂量nZVI处理均降低了数个植物防御和抗氧化活性相关的代谢物水平，像半胱氨酸、甘氨酸、胸腺嘧啶、儿茶素、没食子儿茶素、3-羟基苯甲酸、木糖、十二烷醇、甲硫氨酸、乳酸和 2,4-二氨基丁酸，其中半胱氨酸、甘氨酸、儿茶素、没食子儿茶素、3-羟基苯甲酸是公认的抗氧化自由基清除剂，且是低分子强抗氧化剂的前体。此外，半胱氨酸是硫化物的重要来源，且铁硫复合物是电子转运蛋白的重要组成部分。甘氨酸是改变光呼吸碳的重要指标，控制植物的光合作用和生长；乳酸和4-羟基苯甲酸对植物生长具有刺激作用；十二烷醇和 4-羟基苯甲酸具有抗细菌、抗真菌、抗突变和抗微生物活性；2,4-二氨基丁酸是四氢嘧啶的前体，干旱胁迫时会增加，且可以增强植物对盐度和渗透胁迫的耐受性；没食子儿茶素已被用于昆虫防治。虽然生理生化分析没有发现 nZVI 胁迫下的许多外在变化，但代谢组学分析揭示了高低剂量的nZVI显著下调了低分子量抗氧化剂、植物生长促进剂和相关抗逆成分，这可能损害植物根部的抗氧化和防御系统。当植物在田间经历整个生活史或同时面临生物与非生物胁迫时，上述消极的代谢组学变化的重要性将变得清晰起来。尽管高低剂量nZVI处理下的玉米根系代谢物改变相似，但剂量差异还是引起了一些显著差异，50 mg/kg nZVI下2-吡啶甲酸、奎尼酸、丙酮酸、3-磷酸甘油、果糖、苯酚和 1,5-脱水葡萄糖醇均下调，而500 mg/kg nZVI下却上调，而上述代谢物基本都是抗氧化剂，且与生物或非生物胁迫的信号通路有关。其中的一些代谢物在植物促生和防御方面发挥重要作用，稻瘟病感染麦子时，2-吡啶甲酸能够刺激抗氧化系统并减少光合损伤，甘油是甘油-3-磷酸（G3P）的前体，有助于植物生长和疾病相关响应。也有一些代谢物是涉及能量产生反应的植物防御信号通路的调控器，像糖酵解和甘油酯生物合成通路，果糖是植物适应非生物胁迫的一种信号分子，且能调控光合作用、种子发芽和开花等植物生理过程；奎尼酸、苯酚和丙酮酸具有抗氧化活性，奎尼酸与霉菌感染的响应有关，苯酚在植物木质素和色素生物合成方面发挥重要作用，丙酮酸在需氧呼吸的三羧酸循环中提供能量。总之，上述结果表明500 mg/kg nZVI可以引发玉米更明显的胁迫改变，而50 mg/kg nZVI并没有引发，上述代谢物的下调可能会抑制植物抗氧化能力，对植物长期生长造成威胁。这些结果与上述植物脂质过氧化和多酚水平的结果相匹配，与低剂量下Fe吸收减少有关。当与该研究农艺相关数据相结合，尽管低剂量nZVI处理并未引起玉米生理学的改变，但这些代谢组学数据却揭示了代谢物的特殊变化，这对于田间植物在整个生活史中健康生长非常重要。油酸代谢物的变化趋势比较例外，500 mg/kg nZVI处理下下调，50 mg/kg nZVI却上调，据报道油酸减少可以影响防御相关基因和编码蛋白的表达。油酸水平与G3P呈负相关，也许是为了调控防御基因达到平衡，因此，这一结果也算合乎情理，与上述胁迫依赖性的结果互相呼应。然而，也有报道显示NPs会影响植物基因表达和代谢物调控，因此，为了更深入地了解该研究中观察到相关变化的动力学或持久性，未来需要多研究时间依赖效应而不是固定时间的变化。图4 （A）sPLS-DA分析比较不同浓度nZVI胁迫下玉米根系的代谢组表征，（B）玉米根系 sPLS-DA 分析的 VIP 值揭示了不同浓度nZVI胁迫下的差异代谢物。
 7. 代谢通路分析
对nZVI处理引起的改变进行了更详细的相关通路和网络分析，通路富集分析显示仅50 mg/kg nZVI能够改变8种重要生物学通路，这与上述仅低剂量nZVI引起了更大代谢变化的结果相一致。这8种通路是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰-tRNA 生物合成、嘧啶代谢和丁酸代谢。谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及丁酸代谢均因 L-谷氨酸的激活而上调；而由于 L-谷氨酰胺减少，嘧啶代谢被下调。谷胱甘肽是含量最丰富的低分子量硫醇，在抗氧化和防御系统以及基因表达、信号转导和蛋白质谷胱甘肽化的调节中起着至关重要的作用。脯氨酸在非生物胁迫响应中会被活化，上述代谢通路的活化将有益于植物表型，特别是对各种胁迫的响应；而嘧啶核苷酸可以作为能量载体、核酸亚基以及核苷酸辅酶因子前体；谷氨酸是主要的富N氨基酸，在叶片固氮中扮演重要角色；精氨酸具有最高的氮碳比，是有机氮的最佳储存形式；乙醛酸和二羧酸代谢参与脂肪酸或双碳前体的碳水化合物生物合成。因此，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸生物合成、氨酰-tRNA 生物合成和嘧啶代谢的紊乱可以揭示相应过程或功能的破坏，包括固氮、碳水化合物形成和核酸生物合成，这将对田间玉米的长期生长发育造成影响。此外，与大部分植物-NP 互作的现有文献不一致，本研究并不是通过传统生理生化指标发现剂量依赖性的结果，而是仅通过代谢组学分析才使其凸显出来。因此，该研究证明了代谢组学分析在此类研究中具有的独特而重要的作用，尽管需要更多的未来工作来确定确切的浓度阈值和背后的机制。图5 50 mg/kg nZVI暴露下玉米根系8种通路示意图
箭头表示前体向产物反应的方向，箱型图表示显著改变的代谢物的相对丰度。

结论

该研究中，研究者用代谢组学证明了土壤nZVI胁迫对玉米造成的环境风险，高低剂量均下调了具有影响生长刺激和能量供应的代谢物。尽管低剂量未造成表型的改变，但8种代谢通路均被改变，脂质过氧化和多酚含量的增加清楚地表明氧化应激的剂量依赖性诱导，与抗氧化和应激信号相关的几种代谢物含量的改变进一步证实了这一结果。在低剂量下，某些代谢物的减少可能会干扰植物的抗氧化能力，这表明在遇到胁迫时，这些代谢物的减少可能对植物的长期健康构成严重威胁。玉米对 nZVI 的生理响应也是浓度依赖性的，低剂量下根伸长增加，而高剂量下叶色素含量增加，营养元素积累减少。总体而言，基于 GC-MS 的代谢组学在分子水平上加深了人们对 nZVI 与玉米之间互作机制的理解。该方法在了解真实风险的作用方面相当清晰明确，未来的调查应该着手评估颗粒大小、土壤中 nZVI 的去向和植物中的最终金属形态（尤其是可食用组织）来验证和丰富该研究的结论。

原文链接：  

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452074821000458

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