经典力作|刘耀光-TAIL-PCR的诞生及使用方法

编者按：总是会有人说，周杰伦的经典歌曲是《稻香》，《双节棍》等；刘德华的《忘情水》，《来生缘》等，这些歌曲都是百听不厌，常听常新的，而且听起来的感觉都是不一样的。但是，怎么评价学术界的经典文章或者是成名作呢？有的人认为，发的影响因子越高越好，这样就是经典文章。但是，iNature认为，作为经典文章，肯定使用的人很多，而且看的人也是拍手叫绝，所以我们是根据总引用量，来客观的评价一篇文章。今天就推出刘耀光最高引用量的一篇文章（非综述类），以飨读者。

iNature：热不对称交错（TAIL-）PCR是从酵母人造染色体（YAC）和P1克隆扩增插入片段末端的有效技术。 实现高度特异性扩增，而不需要在PCR之前或之后进行复杂操作。 描述了用于拟南芥中T-DNA插入侧翼的基因组序列的恢复和基因组片段精确的定位。 在190个测试的T-DNA插入系中，鉴定出了183个扩增插入特异性产物。 重新构建实验表明，该技术可以鉴定出普通小麦（1.5×1010bp）的基因组的单拷贝序列。 使用122个独特的侧翼序列探针筛选RFLP，并且在RFLP图上测定26个T-DNA转基因品系的插入位点。 这些植株，其映射的T-DNA插入赋予潮霉素抗性，可以很好的把基因型与表型相联系在一起，这也为后续的T-DNA插入的鉴定奠定了基础。

T-DNA及转座子插入突变已经变得是一种非常重要的工具，对于研究一个新的基因的功能。在那些研究中，很有必要知道知道T-DNA插入在基因组中的侧翼序列。到现在为止，有几种基于PCR的方法已经描述了可以鉴定T-DNA的插入的侧翼序列，在进行PCR之前或者之后，那些方法都需要大量的耗费体力的操作，而且效率比较低下。

TAIL-PCR原理

刘耀光等人发展了一种热不对称交错（TAIL-）PCR的方法，进行靶序列DNA片段的的分离，这些片段与已知的片段相邻，以及使用这种方法从酵母人造染色体（YAC）和P1克隆扩增插入片段末端。这种方法既不需要PCR前的特殊DNA操作，也不需要PCR后的高强度的筛选。另外，PCR产物具有极高的特异性，可直接用于探针杂交或者是Sanger测序。

TAIL-PCR的条件设置

TAIL-PCR分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物(SP Primer)，与经过独特设计的退火温度较低的兼并引物(可以设计多条，AP1、AP2、AP3……)， 进行热不对称 PCR 反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称 PCR 反应，一般通过三次巢式 PCR 反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。

TAIL-PCR特异引物的设计

在这个研究中，刘耀光等人使用这种方法分离出拟南芥转基因T-DNA侧翼序列，这些序列又可以使用限制片段长度多态性的方法进行检测，同时又可以反过来定位到T-DNA的插入位点。使用这种方法，准确的定位26个T-DNA转基因品系的插入位点。 这些植株，其映射的T-DNA插入赋予潮霉素抗性，可以很好的把基因型与表型相联系在一起，这也为后续的T-DNA插入的鉴定奠定了基础。

TAIL-PCR的产物

经过多年的实践，TAIL-PCR可用于以下几方面：

• 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究;

• 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列;

• 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等;

• 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列;

•  用于人工染色体 PAC、YAC 和 BAC 的片段搭接。

将PCR片段定位到基因组上

对于基因组测序已经完成的少数物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的 DNA 序列，只能采用染色体步移技术。 以 PCR 技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异性引物来扩增未知区域。

延伸阅读

原文链接

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1995.08030457.x/abstract;jsessionid=7F439765CEA02A5C7BD477D7AC3B31CB.f03t01

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