基因治疗：大幕正启
文 l 郭佳 45年前，西奥多·弗里德曼提出单基因遗传病可通过给病人提供正确的基因来治疗，修复或替换病人的错误基因，单次治疗可能产生持续的治疗效果。基因治疗目前有几种形式：第一种是基因传输技术（转基因技术），即将正确的基因导入细胞来替代错误的突变基因；第二种是基因编辑技术，直接修复错误基因；第三种是过继细胞疗法，在体外通过基因技术修改目的细胞再输回人体。本期漫投简史将详细阐述基因传输技术和基因编辑技术，过继细胞疗法将单独在细胞治疗章节中进行梳理。
这是漫投简史的第 12 期分享
编辑 l 文璎
作者 l 郭佳
来源 l 漫投简史（ID：metallur）
基因治疗（gene therapy）概念其实很简单：如果一个突变基因引起了问题，就用一个新的正确的拷贝来取代或是补充它，理论上，这样的策略可以治愈人类遗传疾病。
45年前，西奥多·弗里德曼提出单基因遗传病可通过给病人提供正确的基因来治疗，从原理上来说，基于蛋白的治疗药物需要反复给药，而修复或替换病人的错误基因，单次治疗就可能产生持续的治疗效果[1]。
基因治疗先驱西奥多·弗里德曼，图片来自ucsd.edu
本期漫投简史将对基因治疗进行系统的梳理。
基因治疗的种类
基因治疗目前有几种形式：第一种是基因传输技术（转基因技术），即将正确的基因导入细胞来替代错误的突变基因；第二种是基因编辑技术，直接修复错误基因；第三种是过继细胞疗法，在体外通过基因技术修改目的细胞再输回人体。本期漫投简史将详细阐述基因传输技术和基因编辑技术，过继细胞疗法将单独在细胞治疗章节中进行梳理。
基因传输技术需要一种载体把基因带到患者细胞中实现治疗作用，其发展和突破一直围绕着载体技术的不断创新，最常见的载体是利用经过改造后无增殖能力的病毒，当前使用最多的病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒。当然也有不使用载体的非病毒物理法和生物化学法，但基因递呈效率、基因表达率、高靶向性方面相比病毒载体法低，因此病毒载体法深得科学家们的青睐。
一、逆转录病毒载体
逆转录病毒（Retrovirus）又称反转录病毒，属于RNA病毒中的一类。逆转录病毒基因组为二倍体，含有两条相同的单股正链RNA，作为基因治疗载体感染效率高、感染细胞谱系广、基因表达稳定，然而逆转录病毒载体具有病毒毒性、免疫原性、基因插入突变等问题[2]。逆转录病毒载体仍然用于工程T细胞和造血干细胞基因治疗的某些应用。
二、慢病毒载体
针对第一代逆转录病毒局限性，科学家发明了第二代逆转录病毒—慢病毒（Lentiviruses），其对分裂细胞和非分裂细胞均可感染和表达，装载目的基因片段更大，诱发癌变的风险降低，但其病毒毒性、免疫原性、基因整合引起的宿主基因突变等问题依然存在[2]。慢病毒载体是目前大多数造血干细胞应用的首选工具。使用“自我失活的SIN设计，去除慢病毒载体和逆转录病毒载体的内源性强增强子元件，可降低遗传毒性风险。
三、腺相关病毒载体
腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）是单链线性DNA病毒，其进入宿主细胞后以游离DNA形式存在，不会引起宿主细胞基因组的插入突变，并且不同亚型的病毒可以有效地转染各种靶组织，包括肝脏、视网膜、心肌和中枢神经系统，具有特定的组织感染倾向，提高了基因治疗的安全性[2]。但是腺相关病毒可携带的基因片段小，不能容纳超过5 kb的DNA（第一代逆转录病毒和慢病毒载体可容纳>8 kb DNA），另外腺相关病毒载体在有丝分裂后细胞内的长期表达有一定限制[3]。
AAV病毒颗粒示意图和基因组结构
（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014）
基因编辑技术是以改变目的基因序列为目的，介导基因添加、基因删除、基因校正，以及细胞内其他高度靶向的基因组修饰技术[4]。
目前基因编辑技术主要包括以下几种：人工介导的锌指核酸酶技术(zinc finger nucleases, ZFNs)、类转录激活因子效应核酸酶技术(transcription activator- like effectors nucleases, TALENs)、规律成簇的间隔短回文重复相关蛋白技术(CRISPR/Cas9)和单碱基编辑(base editor, BE)技术。
一、锌指核酸酶技术
锌指核酸酶（ZFNs）由一个DNA识别域以及一个DNA剪切域组成。美国犹他大学医学院生物化学系的Dana Carrol团队使用ZFNs注入果蝇胚胎，第一次实现了在动物中的基因编辑；Sangamo Therapeutics利用ZFN技术敲除T细胞上的HIV受体CCR5治疗艾滋病已经完成I期临床研究，并取得了初步的疗效；此外，Sangamo Therapeutics开展ZFN经AAV载体导入人体肝脏，通过基因编辑治疗粘多糖贮积症，正在开展1/2期临床试验，这是世界上首个人体基因编辑的临床研究。
全球共开展13项基于ZFN基因编辑的临床试验，其中北美开展了12项，Sangamo Therapeutics成为其中开展临床试验最多的机构，占据9项，由宾夕法尼亚大学发起2项，Bioverativ Therapeutics Inc.发起1项；中国有1项，由华中科技大学发起正在同济医院开展人乳头瘤病毒（HPV）相关恶性肿瘤的I期临床试验。
尽管ZFNs技术在多个物种中成功进行了基因编辑并已推向临床试验研究，但是锌指蛋白的设计费时费力、成本较高、专利被Sangamo生物公司垄断，限制了该方法的大规模应用。
二、类转录激活因子效应核酸酶技术
2009年，美国爱荷华州立大学植物病理学与生物信息学系的Adam J. Bogdanove团队和德国马丁卢瑟大学生物研究所的Ulla Bonas团队分别发现了来自植物致病黄单胞菌属的转录激活效应蛋白(transcription-activator-like effector，TALE)和DNA的相互作用。将TALE蛋白与FokⅠ酶区域结合构建了新一代的核酸酶编辑技术——TALENs[4]。
TALENs工作原理与锌指酶技术类似，均由DNA识别域和DNA剪切域组成，区别在于DNA序列的识别模式的区别。其工具蛋白设计更简便、可编辑性高、成本降低、细胞毒性也降低。但是TALEN的工具蛋白不可通用，不同的基因仍需特异性的设计，而且脱靶效应也存在很大的风险[2]。
目前全球有4项临床研究在clinical trial上备案开展，中国占据2项，分别为由华中科技大学发起的治疗宫颈癌的研究正在同济医院开展、中山大学第一附属医院正在开展HPV相关宫颈上皮内瘤样病变研究。2018年迈阿密大学米勒医学院使用腺相关病毒（AAV9）递送靶向线粒体的TALEN（mito-TALEN），在肌肉和心脏中有效降低了突变线粒体DNA，有效恢复相关疾病表型。
三、成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术
CRISPR/Cas9系统来源于细菌和古细菌的天然获得性免疫系统，通过CRISPR RNA (crRNA)和trans-activating crRNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白组成的复合体抵御外源性DNA的入侵。2012年CRISPR/Cas9的体外重构和2013年在人类细胞中证明了其基因编辑功能，标志着新一基因编辑时代的开始。
通过检索，目前在clinical trial上备案开展临床研究的有26个，分布如下：
基因治疗的商业化
2018年，全球生物技术最权威的杂志《GEN》发布了《全球10大基因编辑公司》，医疗领域包含Horizon Discovery、CRISPR、Sangamo、Intellia、Editas Medicine、Precision BioSciences、Beam、Inscripta等。还有一些很有前途的公司包括Senti Biosciences、Synthego、Caribou Biosciences、eGenesis等。
国内基因编辑主要代表企业包括博雅辑因、百格生物、寻百会生物、邦耀生物、吉锐生物、赛贝生物、本导基因、克睿基因、本元正阳基因、至善唯新生物、中因科技等。
近年来，随着新型病毒载体的安全性和递送效率的进一步提高，国外已经有几款基因疗法获批上市，近来已经有将近20家药企正在进行关键试验阶段，处于I/II期临床试验阶段的药企。
国外基因传输技术代表公司包括Spark Therapeutics、uniQure、Avexis、Orchard Therapeutics、Bluebird Bio、Regenxbio、GenSight Biologics、Lysogene、Abeona Therapeutics、BioMarin Pharmaceutical、Sarepta Therapeutics、Voyager Therapeutics、Audentes Therapeutics、Solid Biosciences、MeiraGTx Holdings、Nightstar Therapeutics、Oxford BioMedica、Mustang Bio、AVROBIO、Rocket Pharmaceuticals等。
国内基因传输技术代表公司包括信念医药、纽福斯生物、五加和分子医学研究所、和元生物、奥源和力、希元生物、赛百诺基因、精准医疗、唯源立康等。
大型跨国制药公司一直致力于开发具有突破性意义的创新药和治疗方法，基因治疗可谓是“兵家必争之地”。
2016年辉瑞（Pfizer）以6.5亿美元收购Bamboo Therapeutics；2017年Ultragenyx 以1.5亿美元收购Dimension Therapeutics；2018年诺华(Novartis)以87亿美元收购了AveXis；2019年百健(Biogen)以8亿美元收购Nightstar Therapeutics，罗氏(Roche)以43亿美元收购Spark Therapeutics，强生(J&J) 以1亿美元收购MeiraGTx，艾伯维(AbbVie) 和Neurocrine以1.8亿美元收购Voyager Therapeutics。
展 望
基因治疗对于某些疾病是第一次开发了真正的治愈性疗法，一系列突破也正在激起世界对他的瞩目，而与此同时也要记住这个领域还很年轻，还有一些问题亟待解决。
北极光创投宋高广博士指出，在中国，基因治疗药物还面临基础研发、规模化生产和安全性的痛点；从资本的投资维度来说，选择何种载体、何种片段的治疗基因、基因治疗过程中采用何种技术环节、选择何种适应症、政策以及衡量支付体系和技术平台的延伸性等，都是评价一个基因治疗公司的关键核心点[6]。
引用文献
[1] 王承志. 下一个大事件：正在成熟的基因治疗 | 前沿. 知识分子.
[2] 基因治疗方面的核心技术及产业前景. 梅斯医学.
[3] Genetherapy comes of age.
[4] 任云晓, 肖茹丹, 娄晓敏, 方向东. 基因编辑技术及其在基因治疗中的应用.
[5] MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation
[6] 北极光创投宋高广：基因治疗药物的发展现状和投资逻辑. 健一会投资.
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