完整的ceRNA机制研究应包含这些内容

1. 简介

随着ceRNA机制研究的套路化，ceRNA研究越来越难发高分文章，但这并不表示单纯的ceRNA研究已经落伍了，小编发现5月份发表的几篇关于circRNA作为ceRNA的高分研究都是遵循ceRNA研究套路的，为什么能发高分，主要还是实验够量，从多角度多层次分析ceRNA调控机制。小编选取了其中一篇给大家讲解下一篇高分ceRNA文章需要做哪些实验以及哪些分析。

这篇文章是上海交大附属医院黄陈课题组5月份发表在Molecular Cancer（IF10.679）上的文章，该研究发现抑癌基因circCCDC9通过miR-6792-3p/CAV1轴抑制肿瘤进展，为胃癌提供了可开发的生物标志物和治疗靶点。

 2. 文章思路

3. 研究方法与结果

（1）目标circRNA的确定

1）差异筛选：利用RNA测序技术对6组胃癌和癌旁组织进行差异circRNA筛选（高通量筛选差异除了常规的测序和芯片检测外，还可以直接利用公共数据库信息如TCGA、GEO进行数据挖掘），挑选下调最显著的circCCDC9进行后续分析（可以根据表达量挑选候选circRNA，也可以根据关注的方向有针对性的挑选）。

2）确定表达量：扩大样本量，利用qRT-PCR、原位杂交技术（ISH）检测胃癌和癌旁组织中circCCDC9的表达量（扩大样本量进行候选circRNA表达量验证，差异明显才好进行后续研究）。同时检测了各胃癌细胞系中circCCDC9的表达量，挑选表达量最高（MKN45 cells）和最低（AGS cells）的细胞系用于后续研究（这一步是为了方便后面构建沉默/过表达稳转细胞）。

3）临床分析：对circCCDC9表达量与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分级之间的关系进行了分析。同时还进行了KM生存分析，评估circCCDC9与胃癌患者预后的相关性（临床分析特别是预后分析，将circRNA与疾病紧密联系起来）。

4）成环验证：对其成环形式（反向剪接形成还是基因重组形成）进行分析，针对mRNA CCDC9和circCCDC9分别设计引物，利用cDNA和gDNA分别进行PCR扩增，结果显示只有cDNA中能扩增出circCCDC9。Sanger测序进一步验证了circCCDC9是由反向剪接成环的（一些较低分文章通常会忽略了这一步）。

5）稳定性分析：稳定性是circRNA的主要特征之一。利用核糖核酸酶（RNase R）处理上述的PCR扩增产物，结果显示只有circCCDC9不被RNase R降解（这一步同样是较多文章容易忽略的一步）。

6）亚细胞定位：FISH实验结果显示circCCDC9主要位于细胞质中，表明circCCDC9可能在细胞质中行使功能（亚细胞定位有多种方法，除FISH外，还可以用核质分离+qPCR的方法，一般选择一种就可以了）。

7）功能实验（体外）：沉默/过表达细胞中的circCCDC9，分别利用CCK-8 assays、 Colony formationassays、EdU assays等分析沉默/过表达circCCDC9后癌细胞增殖情况，wound healing和transwell assay 分析癌细胞迁移和侵袭情况（细胞表型实验是少不了的，部分文章在这一步也会做体内实验）。

（2）目标miRNA的确定

1）预测目标miRNA: 利用circNET、RNAhybrid、miRanda等软件预测靶向circCCDC9的miRNA，在circCCDC9沉默/过表达细胞系和正常细胞及胃癌和癌旁组织中检测各miRNA的表达情况，确定miR-6792-3p（靶向miRNA的预测软件有多种，部分文章在这一步会将miRNA芯片或测序结果与软件预测结果结合起来分析）。

2）表达量分析：qRT-PCR检测胃癌组织中miR-6792-3p的表达量，ISH检测胃癌组织TMA中miR-6792-3p的表达量，结果均显示miR-6792-3p高表达（靶向miRNA表达显著，才好进行后续分析）。

3）功能实验：沉默/过表达miR-6792-3p，CCK-8 assays、Colony formation assays、EdU assays分析细胞增殖情况，wound healing和transwell assay分析细胞迁移和侵袭情况（靶向miRNA的表型分析同样重要，且理论上其表型变化应与目标circRNA正好相反）。

4）临床分析：结果显示miR-6792-3p与肿瘤大小、淋巴结侵袭和TNM分级密切相关，生存分析结果显示高表达miR-6792-3p对应不良预后（临床分析理论上同样应与目标circRNA相反）。

（3）目标mRNA确定 

1）预测目标mRNA：利用circNET、miRTarBase、RNA22和TargetScan等软件预测miR-6792-3p的下游靶基因，挑选有文献报道，且该课题组有研究的CAV1进行后续的分析（靶向mRNA同样可以用软件预测，但也有不少文章会结合芯片/测序结果）。

2）表达量分析：利用miR-6792-3p mimics/inhibitor分别处理MKN-45和AGS细胞系，结果显示两种细胞系中miR-6792-3p和CAV1的表达负相关（通常情况下，miRNA靶向结合mRNA的3’UTR，负调控mRNA的表达）。

3）结合关系分析：构建CAV1-WT和CAV1-MUT荧光素酶报告载体，结果显示CAV1-WT+miR-6792-3p mimic组中荧光强度显著下降，CAV1-WT+miR-6792-3p inhibitor组中荧光强度上升，但CAV1-MUT+miR-6792-3pmimic/inhibitor两组中荧光强度不变（通常会用荧光素酶报告实验检测两者的结合关系，并对结合位点进行突变处理，观察荧光强度的变化）。

（4）ceRNA调控分析

为了探讨circCCDC9、miR-6792-3p、CAV1三者之间的关系，研究人员做了一系列的验证实验。 

1）调控分析：分别敲减/过表达circCCDC9，检测CAV1的mRNA和蛋白水平变化情况，随后干扰/过表达miR-6792-3p，检测CAV1变化（这一步主要是分析细胞中三者之间的表达情况）。

2）亚细胞定位：FISH实验检测circCCDC9和miR-6792-3p的亚细胞定位（“目标circRNA确定部分”对circRNA进行了亚细胞定位，这里同时对circRNA和miRNA进行亚细胞定位，已确定circRNA可以行使ceRNA调控功能）。

3）结合关系分析：荧光素酶报告实验、RIP、RNA pull-down验证circCCDC9和miR-6792-3p的结合关系（多层次验证circRNA和miRNA的结合关系，部分文章会直接放在“目标miRNA确定”这一部分）。

4）表达量分析：qRT-PCR检测胃癌组织中三者的表达情况，结果显示circCCDC9 和 CAV1表达正相关，circCCDC9和miR-6792-3p表达负相关，miR-6792-3p 和CAV1表达负相关（组织中进一步确定三者表达相关性）。

5）功能回复：敲减/过表达circCCDC9后细胞表型的变化会在miR-6792-3p inhibitor/mimics处理后逆转（功能回复实验进一步证明circRNA和miRNA之间存在拮抗作用）。

（5）体内实验

1）肿瘤变化：circCCDC9过表达载体皮下注射入裸鼠体内构建异种移植瘤小鼠模型，每7天测量小鼠肿瘤体积，28天后测量肿瘤重量，结果显示过表达circCCDC9，显著减小肿瘤体积和重量（体内实验即动物实验一般是少不了的）。

2）表达量变化：qRT-PCR和WB检测小鼠肿瘤组织中CAV1表达情况，IHC检测CAV1、E-cadherin表达上调，β- catenin、cyclin D1、Ki-67表达情况（除了目标mRNA，一般会再检测一些其他肿瘤相关基因的表达情况）。

3）转移分析：静脉注射circCCDC9过表达载体构建肝转移小鼠模型，结果显示过表达circCCDC9的小鼠肝转移程度更低（这一部分可以归属于扩展研究）。

4. 总结

ceRNA机制理论上很简单，circRNA/lncRNA通过调控miRNA，进而调控mRNA的表达，但实际上要讲清楚三者之间的关系，大量的验证实验是必不可少的，多角度多层次去验证，当然验证的方法有很多种，需要一种或多种方法结合来验证，需要视具体情况而定，希望此文能为正在做或即将做ceRNA机制研究的老师提供一些思路。

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