Cell Death Dis(IF=5.959) | 六分的文章告诉你怎样做信号通路

2020年6月4日，来自中国西安交通大学第一附属医院的郑鹏生团队在Cell Death & Disease杂志上发表了题为HOXA5 inhibits the proliferation and neoplasia of cervical cancer cell svia down regulating theactivity of the Wnt/β-catenin pathway and transactivating TP53的研究性论文，证明了HOXA5在宫颈癌病变中是下调的，HOXA5的异位表达通过抑制Wnt/β-catenin通路活性和反式激活TP53抑制宫颈癌的细胞增殖和肿瘤形成。

1. 引言

全球女性所有癌症类型中，宫颈癌的发病率和死亡率位列第四位。根据最新的癌症统计，2018年有56.9万名新宫颈癌病例，31.1万人死亡。现认为宫颈癌的主要原因与人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染有关，但并不是每一个感染HPV的病人都会患上宫颈癌，只有少部分人会患上宫颈癌。这一现象表明，还有其他因素参与了宫颈癌的发生。最近的研究表明，干细胞相关基因与宫颈癌的发生发展有关。因此，有必要在宫颈癌中探讨干细胞相关基因的潜在机制。

HOXA5是一个干细胞相关基因，是同源盒（HOX）基因簇中的一员。HOXA5是参与呼吸系统发育的重要发育调控基因。HOXA5也被认为是与Wnt信号相互拮抗的终末分化标志物。而且，HOXA5在各种癌症中被广泛研究。HOXA5在宫颈癌发生发展中的分子机制尚不清楚。

2. 材料与方法

1) 临床样本：从2015年1月至2018年12月从陕西省核工业215医院收集宫颈癌42例（CC），高级鳞状上皮内病变28例（HSIL），正常宫颈组织55例（NC）。这些患者都没有接受免疫治疗、化疗或放疗。基于FIGO进行了组织学分类和临床分期。

2) 肿瘤异种移植试验：4~5周龄雌性裸鼠(BALB/c)，将细胞悬液5×105皮下注射于裸鼠背部，每隔2-3天测定肿瘤体积。

3) 细胞系和细胞培养:人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、C- 33A、CaSki、HT-3

4) 细胞生长和细胞活力测定:根据计数结果绘制细胞生长曲线, MTT测定细胞活力。

5) 免疫组织化学/免疫细胞化学/ Western blot/流式细胞仪分析/ qRT-PCR/ RNA-seq

3. 研究内容

1）HOXA5在宫颈癌中的表达下调

首先，研究者在收集到的宫颈癌临床样本中发现HOXA5定位于细胞核，且HOXA5在宫颈癌中的表达明显下调。这提示HOXA5可能在宫颈癌的发生发展中发挥抑制作用。

2）体外实验：HOXA5抑制宫颈癌细胞增殖

HeLa和SiHa细胞过表达HOXA5后，细胞增殖能力明显下降。与对照组相比，其细胞活性明显降低。siRNA敲低和CRISPR-Cas9敲除C-33A细胞中的HOXA5可显著提高细胞的增殖能力和生存能力。总之，这些发现证明了HOXA5在体外抑制宫颈癌细胞的增殖。

3）体内实验：HOXA5抑制宫颈癌细胞的形成和增殖

为了探索HOXA5在体内的作用，研究者在裸鼠身上进行了异种移植实验，并监测了实体瘤的发生。注射了HOXA5修饰的Hela细胞的裸鼠，肿瘤生长缓慢，体积更小。过表达HOXA5的细胞增殖标志物Ki67染色更弱。这些结果提示HOXA5可以抑制肿瘤形成和宫颈癌的发生发展，其机制可能与其抑制细胞增殖有关。

4）机制研究：HOXA5对细胞周期的影响

接下来，为了解HOXA5蛋白抑制宫颈癌细胞增殖的机制，首先，研究者采用荧光活化细胞分选方法，分析HOXA5修饰的细胞及其对照细胞的细胞周期。HOXA5异位表达导致G0/G1期细胞百分比显著增加，S/G2/M期细胞百分比下降。相反，敲低HOXA5显著降低了G0/G1期的细胞百分比。这提示HOXA5通过阻断细胞从G0/G1期到S期的周期过程来抑制宫颈癌细胞的增殖。

其次，由于细胞周期是由一组细胞周期相关分子调控的，通过RNA-seq了解HOXA5诱导的表型变化。在395个差异表达基因中，p21（编码基因叫CDKN1A）和cyclinD1（编码基因叫CCND1）这两个细胞周期相关分子发生了显著变化。过表达HOXA5减少了CCND1 mRNA的表达，增加了CDKN1A的表达，敲低HOXA5则相反。p21和cyclinD1蛋白与mRNA结果一致。这说明HOXA5通过cyclinD1和p21阻滞了细胞周期从G0/G1到S期的转变。

5）机制研究：HOXA5与信号通路

(1) Ordonez-Moran等之前报道HOXA5与Wnt通路存在相互拮抗关系[2]。为了进一步检测Wnt/β-catenin通路的变化，通过TOP flash荧光素酶报告基因活性检测，确定在宫颈癌细胞系中HOXA5抑制了Wnt/β-catenin通路的活性。

(2) 那么Wnt/β-catenin的活性是如何被抑制的呢？虽然总β-catenin蛋白水平没有发生变化，但过表达HOXA5的HeLa细胞中，β-catenin在细胞核中的分布明显减少，而在HOXA5敲低时，β-catenin在细胞核中的分布明显增加。这些数据表明，HOXA5在宫颈癌中通过抑制β-catenin蛋白的核转位而抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，从而抑制cyclinD1的表达。

(3) 由于HOXA5在HeLa和SiHa细胞中不与CDKN1A启动子结合，而p21是已知的p53下游因子。那么HOXA5是否通过激活TP53调控p21蛋白的表达？首先，研究者检测了临床乳腺癌样本，并且分析了GEO数据库。结果显示HOXA5的表达与p53的表达呈显著正相关。

细胞实验和荧光素酶报告基因检测结果提示TP53启动子中核苷酸1071~557之间的序列可能含有HOXA5结合位点。此外，研究者进一步在宫颈癌细胞中确定了HOXA5通过其HD结构域直接结合TP53启动子中的5-TAAT-3基序，促进了p21蛋白的表达。

(4) 挽救实验：说明Wnt通路与p53之间不存在交叉对话

研究者通过瞬时转染β-catenin质粒，在HOXA5修饰的宫颈癌细胞中检测了激活Wnt/β-catenin通路的效果。结果表明，上调β-catenin或抑制p53仅部分挽救HOXA5的增殖抑制作用。此外，过表达的β-catenin逆转了HOXA5对c-Myc和cyclinD1蛋白的抑制作用，但不影响p21和p53蛋白水平。

此外，p53特异性抑制剂Pifithrin-phosphate (PFT)抑制p21和p53蛋白的表达，部分挽救过表达HOXA5的HeLa细胞的增殖能力。这些数据提示Wnt通路与p53之间可能不存在交叉对话。

(5)人宫颈癌临床样本：证实HOXA5可能通过Wnt/ catenin/cyclinD1和p53/ p21途径影响宫颈癌细胞的增殖

4. 结论

HOXA5在宫颈病变中是下调的，HOXA5在宫颈癌中，一方面通过抑制β-catenin蛋白的核转位抑制Wnt/ β-catenin信号通路活性，从而抑制cyclinD1的表达。另一方面，HOXA5直接结合TP53，促进了其下游p21蛋白的表达，抑制细胞增殖，从而抑制宫颈癌的发生。

5. 行文思路

这篇六分的SCI文章，我们可以看到的它的工作量很大，思路十分清晰的，逻辑也很严谨，这也是Cell Death &Disease杂志收录的文章特点。做信号通路是个很繁琐的工作，希望你能从中有所收获。好啦，下次的文章解析再见吧！

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