不做ceRNA，肿瘤研究的lncRNA课题设计还能这样写

当我们刚步入研究生阶段，导师常常会给一个大方向，有的时候会给一个目标基因，让我们自己寻找课题思路。目标基因的下游调控常常已经有比较深入的研究，此时向基因上游寻找方向是个不错的选择。对于科研小白来说，可以从近几年国自然的热点lncRNA角度入手。

然而，搜索lncRNA的文献，尤其是肿瘤领域的研究就会发现，满屏都是ceRNA机制的研究，如果这样设计课题，导师一定又会说课题没有创新性了。小编在这里就为你介绍1篇囊括了lncRNA、泛素化修饰、转录因子三大热点的肿瘤研究文章，从头教你如何抛开ceRNA进行肿瘤课题设计。

这篇文章今年发表于《Cell Death and Disease》（俗称小CDD，IF=6.304），由华中科技大学同济医学院完成，是一篇关于lncRNA SNHG12通过干预转录因子蛋白稳定性提高CDCA3表达促进肾细胞癌发展和耐药性的研究。下面我们就来看看这篇文章是如何进行课题设计的吧。

一、立项依据

肾细胞癌（RCC）是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一。由于早期症状不明显，肾细胞癌的患者往往在第一次诊断时肿瘤就已经转移。尽管有舒尼替尼（sunitinib）这样的靶向药物能够治疗晚期患者，6-15个月之后患者通常会出现耐药性，严重影响预后和生存率。因此，解析肾细胞癌发展和耐药性的潜在机制有助于改善治疗效果，提高晚期患者的生存率。

非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200bp、不编码蛋白质的RNA，对基因转录和蛋白质翻译都有重要的调控作用。研究发现lncRNA在肿瘤细胞的增殖转移、凋亡抑制和耐药性方面都具有功能。其中，lncRNA SNHG12（本文的主角）被发现能结合microRNA（长度为22bp左右的非编码RNA），起到“分子海绵”的作用，促进肿瘤增殖转移和上皮细胞转化（EMT）；或是参与多种药物耐药性，然而，其分子机制尚不明确。

为了解析肾癌细胞对舒尼替尼产生耐药性的具体机制，本文作者开展了以下预实验（即研究基础部分）：

（1）通过生物信息学分析筛选参与舒尼替尼耐药性的lncRNA

方法：公共数据库（TCGA-KIRC和GEO）结合测序结果

首先，作者对三组肾细胞癌和癌旁组织进行RNAseq测序筛选差异表达的lncRNA（这里并没有说明样本的癌组织类型和分期，最好还是说明一下）。然后利用TCGA-KIRC数据库（肾透明细胞癌）筛选肿瘤和正常组织中差异表达的lncRNA，再从GEO数据库中选取对舒尼替尼敏感/耐受的肾细胞癌患者数据集（GSE64052），分析差异表达的lncRNA，最后取交集，获得4个候选的lncRNA，其中2个在癌组织中上调表达，2个下调表达。

（2）进一步数据挖掘，锁定SNHG12

方法：Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/），检测细胞和组织中的表达量验证

作者在Oncomine的Yusenko Renal数据中查找四个lncRNA，发现只有SNH12的表达量与肾透明细胞癌患者的总生存率、肿瘤评级和肿瘤阶段相关。单因素和多因素分析后证实SNHG12可作为肾透明细胞癌的独立诊断标志物。（需注意的是Oncomine数据库需要进行注册登陆后方能使用）

RT-qPCR检测RCC细胞系和肿瘤组织中SNHG12的RNA表达量，FISH检测SNHG12在细胞中的定位（细胞核定位）。

（3）寻找SNHG12下游通路

方法：GEO数据集的GSEA分析

对GEO数据集GSE53757（肾透明细胞癌与正常肾组织基因芯片数据）进行GSEA分析，找到相关的若干信号通路，同时筛选与SNHG12表达相关的排名前100的差异表达基因，两者取交集，得到6个肿瘤相关的候选基因。

GSEA网站链接：https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp（GSEA同样需要注册登录，登录后下载软件即可使用）。

（4）在肾癌细胞中敲减/过表达SNHG12，锁定CDCA3

方法：敲减/过表达SNHG12，检测候选基因表达量，生物信息学分析、实验验证相关性

在肾癌细胞（786-O和ACHN）中敲除或过表达SNHG12，qRT-PCR检测筛选到的6个基因，发现仅CDCA3的表达量与SNHG12有一致性趋势。

用TCGA-KIRC数据库确定CDCA3在RCC组织中显著高表达，对SNHG12和CDCA3进行相关性分析确定两者正相关。免疫组化（IHC）、RT-qPCR和WB确定CDCA3 RNA和蛋白在RCC组织中均高表达。

（5）寻找SNHG12与CDCA3之间的工具蛋白

方法：catRAPID和JASPAR预测

以往研究发现一些转录因子可以结合CDCA3的启动子，因此作者首先用catRAPID（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group，一个强大而全面的RNA-蛋白结合预测网站）预测SNHG12与这些转录因子是否互作，并得到转录因子SP1。JASPAR（http://jaspardev.genereg.net/）预测SP1和CDCA3启动子的结合序列。

（6）寻找SNHG12调控SP1方式

方法：检测SP1 RNA、蛋白表达量和蛋白稳定性

    GO富集分析和GSEA分析揭示SNHG12参与泛素化相关通路。在SNHG12敲减/过表达的肿瘤细胞中，RT-qPCR和WB检测SP1的表达量，发现结果不一致，猜测SNHG12影响蛋白稳定性。用蛋白合成和降解抑制剂（CHX和MG132）分别处理上述细胞，WB检测SP1蛋白和泛素化水平，确定SNHG12高表达促进SP1蛋白稳定性。

基于以上研究基础可提出假说：lncRNA SNHG12通过结合SP1，阻碍其泛素化降解过程，维持其蛋白稳定性，从而提高CDCA3转录水平表达，促进肿瘤发展和耐药性。假说图如下：

二、研究内容

（1）体外细胞实验验证：SNHG12通过CDCA3增强肿瘤细胞增殖转移

方法一：敲减/过表达SNHG12，CCK8、Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力，流式细胞仪检测细胞周期。

结果：敲除SNHG12细胞增殖、侵袭和迁移能力减弱，细胞周期停留在G0/G1期；过表达SNHG12细胞增殖、侵袭和迁移能力加强，细胞周期进入S期。（S期的主要任务是合成DNA，说明细胞处在活跃的增殖阶段）

方法二：功能回复实验：在SNHG12敲减细胞中过表达CDCA3，在SNHG12过表达细胞中敲减CDCA3，重复方法一中的实验。（功能回复实验比较考验逻辑，设计的时候不妨画张简易模式图标注会更清晰）

结果：在SNHG12敲减细胞中过表达CDCA3和在SNHG12过表达的细胞中敲减CDCA3能回复对照表型。

（2）体外细胞实验验证：SNHG12通过CDCA3提高肿瘤细胞对舒尼替尼的耐药性

方法：GSEA分析SNHG12、CDCA3与肿瘤细胞耐药性的关系；RT-qPCR、WB检测耐药细胞中SNHG12、CDCA3的表达量；在耐药细胞中敲减/过表达SNHG12和CDCA3，舒尼替尼处理后CCK8检测细胞增殖情况。

结果：SNH12和CDCA3均促进肿瘤细胞耐药性。敲减SNH12或CDCA3能有效降低耐药性。

（3）分子实验验证：SNHG12/SP1/CDCA3互作机制

方法：RIP检测SNHG12与SP1的结合，ChIP、荧光素酶报告基因实验检测SP1与CDCA3启动子的结合；敲减/过表达SP1，RT-qPCR、WB检测CDCA3表达量。

结果：SNHG12与SP1结合，SP1直接结合CDCA3启动子GGGGGCGGGGG结构域。敲减/过表达SP1，CDCA3表达量相应降低/升高。

（4）动物模型验证：敲减SNHG12抑制肿瘤细胞发展，降低耐药性

方法：敲减SNHG12的耐药肿瘤细胞皮下接种裸鼠，成瘤后注射舒尼替尼，20天后检测肿瘤大小，WB、免疫组化检测CDCA3在肿瘤组织中的表达。

结果：敲减SNHG12并使用舒尼替尼后，肿瘤生长得到抑制，耐药性降低。

技术路线：

（灰色表示预实验，蓝色表示研究层面，红色表示功能回复实验）

三、研究目标

（1）阐明SNHG12/SP1/CDCA3互作的具体机制；

（2）阐明SNHG12/SP1/CDCA3轴促进肿瘤增殖、侵袭转移和耐药性机制。

四、特色与创新之处

（1）肾细胞癌对舒尼替尼产生耐药性的机制尚不清楚，本文通过公共数据库和作者测序获得的结果综合筛选目标lncRNA，并证实其调控轴SNHG12/SP1/CDCA3对肿瘤耐药性的作用。

（2）以往报道SNHG12在肿瘤中的功能为调控microRNA的“分子海绵”，而本文则从另一个调控泛素化修饰的角度解析了lncRNA的作用。

五、总结

本文的结构和实验设计符合国自然申请的“套路”，实验方法比较常规，如果你正打算开展课题设计，或是想发表6分左右的文章，本文将是一个不错的参考。

不足之处有：①SNHG12、CDCA3增强肿瘤细胞耐药性的具体下游机制和通路并没有进一步得到解释，需要开展更多的工作探索。②文中并没有展示SNHG12与SP1互作的结合位点，同样需要突变实验验证。③功能回复实验中缺乏SP1敲减/过表达转染SNHG12敲减/过表达细胞，动物模型验证也没有加入功能回复实验。如果想要做更深入的工作，以上几点必不可少。

这样的课题设计思路，你学会了吗？相信用类似的方法寻找课题方向，导师定会对你刮目相看。

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