LinLin：昨天无花果童鞋分享了一个叫作【dCAS9-ChIP】的前沿技术，今天LinLin和胖师兄来给大家说段相声（错了，是说篇文章），这里面就应用到了dCAS9-ChIP这一技术来包装它的内核机制。胖师兄：其实就是个lncRNA结合转录因子的RBP机制，整这些弯弯绕干啥？抬高GDP？LinLin：lncRNA研究可以说是老生常谈了，根据lncRNA的亚细胞定位，我们会选择不同的研究模式。如定位于细胞质中的lncRNA主要是调节mRNA稳定性，影响翻译及翻译后修饰；定位于细胞核中的lncRNA主要通过影响染色质重构，与结合蛋白相互作用参与转录调控。胖师兄：很多童鞋做非编码都不知道先做做FISH定位或者核质分离PCR就敢说自己这是什么机制，难道是梁静茹给你的勇气？
LinLin：ceRNA调控机制是细胞质lncRNA最常见的转录后调控模式，也是我们一提到lncRNA，最先冒出来的研究思路。
胖师兄：给你们面子了，估计很多人只能想到这个机制吧。LinLin：我们通常会忘了细胞核lncRNA该如何进行研究。
LinLin：今天要给大家分享的是今年发表在Journal of Hematology & Oncology (IF=11.059)上的一篇文章“Long non-coding RNA HUMT hypomethylation promotes lymphangiogenesis and metastasis via activating FOXK1 transcription in triplenegative breast cancer”，文章研究发现细胞核lncRNA通过与结合蛋白YBX1形成转录复合体从而调控下游靶基因FOXK1的表达，进而影响TNBC的淋巴结转移。接下来，我们一起来看下如果要进行细胞核lncRNA研究，该如何进行课题设计。
一、立项依据
乳腺癌是世界范围内女性最常见的癌症，其发病率呈上升趋势。尽管三阴性乳腺癌（TNBC）与其他乳腺癌亚型相比，临床表现更差，治疗手段更少，内分泌治疗和常规靶向治疗对TNBC均无效，目前的一线治疗方案仍是手术和化疗。虽然TNBC仅占乳腺癌的10-20%，但其侵袭性和恶性程度较高，淋巴结转移率较高，而中位生存期较短。因此，研究新的TNBC淋巴结转移的生物标记物和分子机制对于TNBC治疗尤为重要。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个碱基的一类特殊转录本，其编码能力有限。以往的研究发现lncRNA能够多水平参与调控的基因表达，如通过影响DNA甲基化或转录因子活性来调控基因转录。此外，lncRNA还能作为内源竞争性RNA或蛋白稳定剂在转录后水平调控基因表达。尽管有报道称有大量lncRNA在乳腺癌中异常表达，参与包括细胞凋亡，增殖，代谢和转移在内的癌症特征，但大多数lncRNA在TNBC淋巴结转移和免疫应答中的作用和机制尚不清楚。为确定TNBC淋巴结转移相关的lncRNA并分析其参与的分子机制，研究人员进行了如下预实验：研究人员首先将常规TNBC细胞转移到裸鼠脂肪垫中，筛选高淋巴结浸润性细胞重新注射到新的裸鼠体内，重复操作后，利用全基因组芯片筛选第三代高淋巴结浸润性细胞（231LNM3、549LNM3）中差异表达lncRNA，确定HUMT，用qRT-PCR验证，并进一步利用TCGA数据分析TNBC组织及泛癌组织中HUMT的表达水平进行验证。（胖师兄：做个芯片还放原理图，是以为这是多么高大上的实验吗？）
利用生信分析软件NCBI ORFfinder、PhyloCSF及CPAT预测HUMT的编码能力。检测SYSUCC来源的228例TNBC中HUMT表达水平，将样本分为高低HUMT组，分析HUMT表达与临床病理特征相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析HUMT表达与OS和DFS相关性，qRT-PCR检测分析有无淋巴结转移TNBC中HUMT表达差异。
DNA甲基化是表观遗传调控基因表达的最常见方式之一，因此研究人员对启动子区的甲基化水平进行了生信分析，结果显示为低甲基化，同时HUMT启动子区有CpG岛。利用TCGA和CCLE数据进行分析，结果均显示所有乳腺癌中DNA甲基化水平与HUMT表达负相关。（胖师兄：这里就是拉来一个DNA甲基化机制强行凑上游，把HUMT打造成本研究主角基因，大家这部分可以忽略，也可以看看甲基化研究怎么玩的，后面我们应该会有专门的甲基化研究套路分享给大家）
3. HUMT招募YBX1形成转录复合体进而调控FOXK1表达
为确定HUMT调节TNBC癌症进展的具体机制，研究人员利用lncATLAS预测，核质分离结合qRT-PCR以及FISH验证HUMT的亚细胞定位，确定近一半lncRNA位于细胞核。lncRNA通过招募相应蛋白在转录中起重要作用，GEO数据分析显示DNA结合蛋白YBX1可能与HUMT结合，RIP结合RNA pulldown确定两者的结合关系。YBX1在转录中起重要作用，对ENCODE数据库中YBX1蛋白的CHIP-seq结果进行分析，初步确定FOXK1。对YBX1和FOXK1的结合关系进行生信分析并结合ChIP及HUMT敲减实验，确定YBX1与FOXK1启动子区结合。同时生信分析显示HUMT和YBX1的表达与FOXK1正相关，qRT-PCR检测显示敲减HUMT或YBX1显著降低FOXK1表达水平。
FOXK1介导细胞增殖和血管内皮生长因子信号传导，为确定HUMT是否通过FOXK1行使作用，敲减HUMT，WB结果显示FOXK1、 p-Akt、 p-mTOR和 VEGFC蛋白水平均显著下降，而过表达FOXK1能部分逆转上述表达变化。
基于上述预实验研究结果，研究人员提出如下科学假说：低甲基化水平促进lncRNA HUMT的高表达，HUMT与结合蛋白YBX1形成转录复合物作用于FOXK1启动子区，上调FOXK1的表达进而激活下游通路，从而促进细胞增殖、淋巴管生成。假说图如下：（胖师兄：这种分镜形式的假说图大家可以学习一下，还是蛮清晰的）
二、研究内容
利用HUMT敲减（HUMT-KO）的231LNM3、549LNM3细胞分别构建淋巴结转移小鼠模型，分析小鼠的生存率、淋巴结转移率及转移性淋巴结体积变化，结果均显示HUMT促进TNBC淋巴结转移。
利用qRT-PCR检测各乳腺癌细胞系中HUMT表达量，确定HUMT高表达细胞系MDA-MB-231和BT549。利用GEO和TCGA数据分析基底样和非基底样TNBC患者中HUMT表达水平。
淋巴结转移与肿瘤细胞增殖和转移性质始终呈正相关，因此利用CRISPR构建HUMT-KO细胞系，CCK8、菌落形成、伤口愈合和Transwell以及3D侵袭实验分析细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化，并分析HUMT-KO对HLEC(人淋巴内皮细胞)成管能力的影响。
利用甲基化转移酶抑制剂DAC处理HUMT启动子高甲基化的TNBC细胞系，结果显示HUMT表达水平显著降低。TCGA的全癌数据分析显示HUMT的表达与启动子区CpG岛的甲基化水平显著负相关。
4. HUMT招募YBX1形成转录复合体进而调控FOXK1表达利用dCas9-ChIP技术分析HUMT与FOXK1的启动子结合关系（胖师兄：其实没必要一定用这么死贵死贵的新技术啊，ChIP+截断体构建来验证不香吗？），结果显示FOXK1启动子靶向的gRNA显著富集HUMT。WB分析显示过表达YBX1或HUMT上调FOXK1，而沉默YBX1或HUMT则部分逆转FOXK1上调现象。细胞表型实验显示敲减YBX1或HUMT，显著抑制TNBC细胞的增殖，同时生信分析显示FOXK1与基底样乳腺癌患者的无转移生存期差相关。
5. FOXK1介导TNBC细胞增殖、转移和淋巴管生成（体外实验）对HUMT稳定表达的TNBC细胞进行FOXK1敲减处理，细胞表型实验显示其能逆转HUMT过表达引起的细胞迁移和侵袭、淋巴结转移的变化，同时WB分析显示能逆转FOXK1下游通路分子的表达。
6. HUMT促进TNBC细胞增殖、转移和淋巴管形成（体内实验）构建异种移植瘤小鼠模型结果显示过表达FOXK1能逆转HUMT敲减引起的肿瘤生长变化。同时构建淋巴结转移和肺转移小鼠模型，结果显示淋巴结变化受FOXK1和HUMT的协同作用，同时IHC分析证实敲减HUMT，影响肺转移，qRT-PCR进一步表明FOXK1的表达与HUMT正相关。为确定HUMT作为治疗靶点的潜在作用，敲减HUMT，显著抑制肿瘤生长。
利用 KM plotter评估HUMT在不同癌症中的预后价值，同时评估SYSUCC的TNBC患者中HUMT和FOXK1的临床表达相关性。qRT-PCR分析HUMT与YBX1，FOXK1之间的表达相关性。ROC生存曲线分析HUMT与TNBC肿瘤分期相关。WB分析确定TNBC淋巴结转移患者的FOXK1蛋白水平较高。
（绿底部分为研究主线内容，蓝框部分为预实验内容，红线部分为功能回复实验）
三、研究目标
1. 阐明TNBC中高表达的HUMT的表达受表观遗传调控；2. 阐明HUMT通过招募YBX1形成转录复合体，调控FOXK1的表达，激活下游调控通路，影响细胞的增殖、转移和淋巴管生成。四、特色与创新之处
1. 本文获取淋巴结高浸润性TNBC细胞的方法很有创新性，其通过移植TNBC细胞到裸鼠体内，然后筛选转移的淋巴结浸润性细胞进行裸鼠移植传代，从而获得了高质量高纯度的淋巴结高浸润性TNBC细胞；2. 本文从表观遗传调控到转录调控多个层面分析了lncRNA HUMT参与调控TNBC淋巴结转移的具体分子机制，为TNBC的分子靶向治疗提供新思路。五、总结
本文阐述了TNBC中低甲基化水平引起lncRNA HUMT的高表达，HUMT通过招募结合蛋白YBX1调控FOXK1的表达，而高表达FOXK1能够激活下游的细胞增殖和淋巴管生成相关的通路，从而促进TNBC淋巴结转移。文章逻辑清晰，从生信分析到体内外分子实验再到临床分析，较为全面的阐述了HUMT的分子调控机制。（胖师兄：逻辑确实不错，就是新技术扎堆有些炫技之感，其实就思路而言就是个Oncogene水平吧，而且人家还有可能瞧不上）文章运用了多种较为新颖的技术，如高淋巴结浸润性TNBC细胞的获取技术，技术不难，但创新性很强，这种方法获取的细胞更贴近临床表型，更具有临床研究意义；（胖师兄：这点创新点确实很突出，大家也要学会依据各自研究的不同病理状态来自己改良商品化的细胞株，它们可不一定“召之即来，来之能战”）分析基因间结合关系的dCas9-ChIP技术的运用确定了HUMT能与YBX1形成转录复合体从而调控靶基因FOXK1的表达，关于这一技术我们前期已经有专门介绍，有兴趣同学看下次条。整体来说这是一篇设计合理，思路严谨，方法新颖的细胞核lncRNA研究文章，想进行lncRNA研究，又想有一定创新性的各位可以借鉴下。（胖师兄：最大亮点在细胞，其次是逻辑缜密性，技术嘛大家看看自己项目余额或者去抱抱导师大腿？）阅读推荐：