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【前沿技术】高水平研究经常用到的基因筛选方法,你Get了吗?

无花果 科研讲坛 2021-02-21
大家好,我是只想躺着吹空调的无花果。
最近天气持续炎热,不仅容易精神萎靡不振,连做实验都提不起劲。可是为了科(wan)研(cheng)事(ke)业(ti),再忙再累也得兼顾实验啊。就怕辛辛苦苦做出的成果创新性不够,只能发个名不见经传的小文章。
有没有既高效经济又能挖掘到新颖有意思的研究方向,还能发表高分论文的方法?看看近几年在CNS上发表的文章,除了免疫、肠道微生物这样的热点外,大神们似乎都把目光投向了这一高通量筛选技术——CRISPR文库筛选

什么是CRISPR文库筛选?
CRISPR基因编辑技术想必大家都不陌生——CRISPR源于细菌的免疫系统,是为了清除入侵体内的病毒进化出的一套DNA清除机制:细菌能够产生一种与目标DNA互补的RNA片段(向导RNA)和一种特殊的DNA切割酶Cas,Cas能够识别向导RNA并对与之结合的DNA进行特定位点的切割。这一机制后被科学家用于开发出可编辑任意DNA的分子工具CRISPR/Cas9系统,较广泛使用的方法是将Cas9蛋白(编辑器)和目标基因的sgRNA(向导RNA)导入细胞中,从而实现对目的基因的敲除。随着这一技术不断发展,又衍生出不同Cas蛋白对基因进行敲入、增强等操作,实现了对多个物种,尤其是人类基因组的全方位编辑
CRISPR文库筛选,顾名思义,就是将不同基因的sgRNA混合构建为文库转入特定细胞,实现高通量基因敲除,再根据需要进行表型筛选、测序,从而挖掘到与表型相关的基因。

下面将通过一篇近期发表于 Cancer Cell 上的文章,为大家具体介绍这一强大的筛选技术。


发表时间:2020年6月
发表期刊:Cancer cell (IF:26.602
作者单位:宾夕法尼亚大学免疫研究组
CRISPR文库筛选流程:

蓝色:前期准备;绿色:筛选过程;橙色:后期验证
 
本文中的筛选流程:


1、科学问题及细胞模型
过继性T细胞转移免疫治疗(ACT)是一种利用患者自身肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和基因修饰的T细胞治疗恶性肿瘤的方法,在近年来的临床治疗中取得了良好的效果(没错,著名的“CAR-T免疫治疗”就是其中之一)。
这一治疗的主要流程为:提取患者体内肿瘤浸润T细胞—T细胞筛选、基因工程改造—输回患者体内。其中,第二个步骤的T细胞筛选是关键步骤,维持T细胞的适应性、扩增分化等多种特性对增强T细胞的抗肿瘤效果非常重要,然而目前的干预药物只能对其中某一个因素作用,往往顾此失彼,无法达到理想的效果。本研究试图通过CRISPR/Cas9文库筛选找到既能增强T细胞抗肿瘤作用,又能保留新抗原特异T细胞群落的药物靶点。
科学问题:在ACT治疗的T细胞培养过程中,筛选敲除后能提高T细胞杀伤肿瘤能力的激酶
筛选细胞:TCR激活的小鼠CD8+T细胞
2、CRISPR文库构建
使用文库:包含25个激酶的激酶库,每个激酶设计3条sgRNA4个表型分为4组,每组设置2个重复。选取无靶向(阴性对照)和β2m(阳性对照)的sgRNA加入库中。
3、CRISPR文库筛选
筛选表型:
① 细胞增长 ② 细胞干性(记忆标志物CD62L) ③ 氧化压力(ROS) ④ DNA损伤压力(标志物γH2AX)
筛选方法:流式细胞仪分别分选表型为细胞增长加快、CD62L上调,ROS下调、γH2AX下调的T细胞。


4、测序及生信分析
分析方法:
(1)根据4种表型将测序结果分别排序;
(2)使用“基因多效性评分”方法进行打分;
(3)运用“排名第二sgRNA标准”为25个激酶排序;
(4)选取两组重复(screen1和screen2)中排名靠前的交集;
(5)将4种表型综合进行多效性评分,最终获得排名最高的激酶Mapk14(p38α)。


5、表型验证
①设计新sgRNA转染细胞敲除p38基因,验证4种表型
新sgRNA能有效敲除p38,且4种表型变化符合预期(细胞增长加速,CD62L增加,ROS降低,γH2AX降低)。


②使用p38激酶抑制剂模拟敲除效果,验证4种表型(非永久性敲除,适用于临床
TCR激活的T细胞使用抑制剂BIRB796,4种表型变化与p38 CRISPR Cas9敲除细胞一致。


6、功能验证
(1)体外验证
p38抑制剂(p38i)对细胞内ROS水平的影响
代谢组学数据显示氧化还原相关代谢物水平变化。检测与其密切相关的谷胱甘肽(GSH和GSSG)的含量、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等表达量,确定p38i细胞中ROS通路下调。


②p38i对T细胞记忆分化的影响
对加入p38i培养的T细胞进行RNAseq,GSEA分析显示了抑制p38后DNA修复、凋亡、mTORC1等途径的转录水平有显著变化,与前述4种表型相吻合。


(2)体内验证
①提取黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞,p38i培养后分析各项指标
TIL(肿瘤浸润的淋巴细胞)在p38i处理20天后,TCR激活的T细胞类群不变,T细胞增长加速、CD62L+细胞数量增多。


②p38i培养基因工程T细胞(NY-ESO-1 TCR和αCD19-CAR),分析各项指标
加入p38i培养不影响基因工程T细胞的转导效率,并且显著保留了CD62L+/CD8+/CTR+T细胞,促进工程细胞分泌细胞因子IFNγ。 



③p38i体外培养T细胞输回小鼠体内,检测抗肿瘤能力
将p38i体外培养的T细胞回输小鼠体内,T细胞杀伤肿瘤能力增强,小鼠生存期显著延长,肿瘤缩小。


总结
本文追踪的是时下最热的免疫治疗研究,整个故事从基因筛选到表型功能验证十分完整,具有很强的临床意义。本文最大的亮点是在CRISPR/Cas9筛选激酶的环节,这一部分的筛选表型选择测序后的分析是挖掘到关键基因的决定性因素。
这就告诉我们,CRISPR基因敲除筛选看起来步骤简单,但是真正操作起来,从科学问题的确定、细胞模型的选择、sgRNA的设计,到筛选后细胞表型的选择、后续的测序数据分析和功能实验设计,都是需要仔细推敲和定夺的。好的筛选策略能达到事半功倍的效果,而欠佳的筛选策略不仅费钱费力,甚至可能最终都拿不到理想的结果。
尽管如此,CRISPR筛选技术相比于其他方法(如酵母文库筛选、组学数据分析等)依然具有成本低、效率高、操作简便、假阳性率低的优点,是一个性价比高,值得拥有的筛选技术。
这一被“大神”们青睐的筛选技术,你准备Get了吗?
联系猫头鹰博士,开启高分模式~

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