浅谈干细胞治疗1 型糖尿病的临床进展
前言 /
目前1型糖尿病的治疗以胰岛素替代疗法为主，但近年来该疗法未能进一步提高年轻患者的生存率。与胰岛素替代疗法不同，干细胞疗法旨在恢复患者正常的产胰岛素功能，从而使 1型糖尿病患者部分或完全康复，减少外源性胰岛素及药物依赖，并减少并发症的发生。
目前具有进展的干细胞疗法主流研究包括诱导性多能干细胞疗法、间充质干细胞( MSCs) 疗法以及骨髓来源的造血干细胞( HSCs) 疗法。此三种疗法在细胞和动物实验水平获得了积极的结果，HSCs 和 MSCs 疗法已进入临床试验阶段，部分临床试验也已取得了积极的结果，这些研究结果提示干细胞疗法用于临床治疗1型糖尿病的可行性。
细胞王国·主编/ 摩西
细胞治疗行业第三视角
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根据国际糖尿病联盟( http:/ /www. diabetesatlas. org / ) 的统计,截至2019年全球糖尿病患者超4. 63亿,预计2045年将增至7亿。中国已成为糖尿病第一大国,患者超过1.16亿。
1型糖尿病是一种针对胰岛β细胞的自身免疫性疾病，相较于2型糖尿病，患者多饮、多尿、多食和体重减轻的“三多一少”症状更为典型，以年轻患者居多，急、慢性并发症(以酮症酸中毒、糖尿病肾病以及心血管疾病等为主) 的发生率更高，病情进展更快，患者的预后和生存质量也更差。
目前针对1型糖尿病的治疗方式较为有限，主要是胰岛素替代疗法，但胰岛素替代疗法只能补充患者缺失的胰岛素，并不能从根本上恢复胰岛功能，从而治愈1型糖尿病，尤其是对于早期发病的年轻患者，现有治疗方法未能明显降低20～44岁患者的死亡率。因此，迫切需要寻找新的治疗方法以降低患者的死亡率和并发症发生率，提高患者生活质量。
在各种新的治疗方法中，干细胞疗法是一种能恢复正常胰岛功能并取代外源性胰岛素治疗的新疗法。干细胞疗法治疗1型糖尿病历经数十年的发展，在实验室水平和临床研究中均取得了一定的进展并有患者从中获益。现从1型糖尿病的发病机制、主流干细胞疗法的研究方向、实验室水平以及临床试验结果等方面介绍干细胞疗法治疗1型糖尿病的新进展。
1型糖尿病的发病机制
1型糖尿病的发病过程为自身免疫抗体和免疫细胞异常攻击胰岛β细胞，导致胰岛β细胞减少或失去功能，包括分泌胰岛素和感知血糖水平变化等功能出现缺损或缺失，最终导致血糖异常升高。具体来说，机体免疫系统无法正确识别胰岛细胞表面的自身抗原或将胰岛β细胞识别为异常组织，其表面或分泌的抗原被树突状细胞或巨噬细胞呈递给CD4+T细胞或 CD8+T细胞，CD4+T细胞激活B细胞的增殖分化，并释放特异性抗体攻击胰岛β细胞。
特异性抗体识别的胰岛β细胞的靶点主要是胰岛素和谷氨酸脱羧酶6，针对这两种靶点的抗体出现的时间通常＜2周岁，此后针对酪氨酸磷酸酶样分子IA-2或锌离子转运蛋白8的自身抗体可出现上调，但其产生的具体机制和作用尚待明确。除自身免疫抗体外，被激活的CD8+细胞毒T细胞也可直接损伤β细胞或与自身免疫抗体共同作用导致细胞损伤，但其造成损伤的程度可能在不同患者中表现不一。
1型糖尿病发生发展的过程离不开遗传和环境因素的共同作用。遗传因素包括第6号染色体上编码人类白细胞抗原( human leucocyte antigen，HLA) 2类分子基因的单倍型HLA-DR3-DQ2、HLA-DR4-DQ8和编码胰岛素基因，这两类基因主要调控免疫系统( 产生自身免疫抗体、改变免疫细胞反应活性) 和分泌胰岛素。研究发现，与上述两类基因不相关的基因也可能与1型糖尿病的患病风险相关。
影响1型糖尿病的环境因素贯穿产前产后两个时期。妊娠期环境因素主要包括先天性麻风、孕产妇肠道病毒感染、剖宫产、胎儿体重超标、产妇高龄以及蔬菜摄取过低等;
针对新生儿的环境因素包括肠道病毒感染，频繁换气，肠道菌群异常，过早接触谷物、鸡蛋、牛奶和根茎类蔬菜，超重以及各种严重的新生儿疾病; 新生儿期后，婴幼儿持续或反复的肠道感染、
超重或体重增长过快、高血糖负荷或果糖摄入过多、食物中硝酸盐和亚硝酸铵过量、接受糖皮质激素疗法，甚至青春期激素水平变化以及精神压力过大亦可影响1型糖尿病进展。
以上遗传和环境因素共同作用，最终在胰岛组织内形成了由自身免疫反应引发的炎性病灶，破坏胰岛β细胞，使患者丧失正常的产胰岛素功能。而干细胞疗法正是从1型糖尿病的发病机制出发，从内分泌细胞和免疫细胞两个方面，试图恢复患者正常的产胰岛素功能，改变患者异常的自身免疫状态，继而从根本上治愈1型糖尿病。
1型与2型糖尿病的发病机理
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来源：https://www.sohu.com
干细胞治疗1型糖尿病临床前进展
目前在实验室水平上用于1型糖尿病治疗的干细胞有胚胎干细胞、诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem cell，iPSCs) 、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs) 、骨髓来源的造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSCs) 以及胰腺内的多能前体细胞、前体细胞以及存在于胰腺外(脾脏、肝脏、子宫内膜)的β细胞前体细胞。
干细胞治疗1型糖尿病是基于干细胞的自我更新功能和潜在的定向分化功能，相较于完全异体胰腺组织移植，移植前能够在分子水平进行严格的质量控制，并能对移植细胞质量和免疫排斥反应进行有效评估，因而干细胞疗法可以部分或完全避免免疫排斥反应所导致的移植失败和移植术后并发症。
目前1型糖尿病的干细胞疗法除少部分进入临床试验外，大部分研究还处于细胞和动物实验水平。在实验室水平利用 iPSCs、MSCs、HSCs 和胰腺外细胞治疗1型糖尿病的研究已在不同程度上取得了进展，其结果也成为行临床试验的证据和保障。利用胚胎干细胞治疗 1型糖尿病虽然在理论上可行，但成功率低以及伦理学上的问题影响了研究进展，故不予详细介绍。
iPSCs疗法
iPSCs治疗1型糖尿病属于再生医学范畴，其基本原理是将体细胞逆转为早期未分化的多能干细胞，再经各种细胞因子处理以模仿胚胎细胞的生长发育过程，诱导其成为具有分泌胰岛素功能的胰岛β细胞。与胚胎干细胞不同，iPSCs只能形成新的组织和器官，而不能形成新的个体，所以能够避免潜在医学伦理问题，且因细胞来源于患者本身，所以还可减少或完全避免免疫排斥反应。
IPSCs疗法治疗1型糖尿病的操作流程为: 首先通过过表达聚体结合转录因子3 /4、性别决定区盒2因子、Krüpple 样因子4以及 c-Myc四种转录因子将体细胞转化成具有多种分化能力并能够自我更新的原始干细胞，然后利用化学药物或纯化的细胞因子调节各种多能干细胞的生存通路和分化通路，包括节点激活素信号通路、Wnt通路、视黄酸信号通路、Hedgehog 信号通路、成纤维细胞生长因子通路、表皮生长因子通路、骨形态发生蛋白通路以及Notch信号通路等。
在各种信号通路的影响下，多能干细胞从最初的原始状态逐步分化成为内胚层细胞、原始肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层细胞、内分泌前体细胞，最后分化成为胰岛β细胞。以上过程需要在体外对细胞进行诱导分化，并根据不同分化阶段细胞的表面细胞标志物鉴定、筛选以及纯化分化后的克隆株，避免在任何分化步骤中出现非目标细胞而导致分化效率降低，或因不受控制的增殖造成严重的不良反应，移植后患者还需接受严格的评估以判断移植是否成功以及有无严重的不良反应，如非胰岛β细胞异常增殖所形成的肿瘤，或胰高血糖素、生长抑素等非胰岛素激素的异常升高等。
由于iPSCs疗法体外诱导过程复杂，目前利用iPSCs治疗1型糖尿病仍停留在实验室阶段。Pellegrini等利用人类来源的 iPSCs 在体外诱导分化成为胰岛β细胞，随后将其移植到小鼠体内，结果发现，移植的细胞对体内葡萄糖水平有反应。来自中国和日本的课题组成功地从 iPSCs 诱导出具有胰岛素分泌功能、可感受人体血糖水平并进行反应的细胞，且移植后可在短期内维持小鼠的正常血糖水平。由于iPSCs 强大的分化能力，即使非常严格控制细胞的分化类型，移植分化终末端的细胞可能还会出现不受控制的增殖并形成肿瘤，也可能产生胃泌素或生长抑素等其他胰岛细胞相关激素。若出现这些不良反应，相较于传统疗法，iPSCs疗法的弊端可能大于治疗本身获益，故对于iPSCs治疗1型糖尿病还需要更深入的临床前研究以增加其安全性和可靠性。
MSCs疗法
MSCs存在于骨髓、脐带以及脂肪组织中，与iPSCs相比，MSCs虽然具有一定的定向分化功能，但并不能形成一个完整的器官。普通未经诱导处理的MSCs一般可以分化为成软骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞以及神经细胞，对MSCs进行一定的基因修饰后，其也可以分化为具有分泌胰岛素功能的细胞。MSCs相对局限的分化能力能够避免iPSCs 疗法移植细胞出现非胰岛β细胞的异常增殖分化。
已有研究表明，人类骨髓来源的MSCs经过体培养或通过病毒转染转录因子基因胰岛素启动因子1、HLXB9 和叉头框转录因子A2可转化为具有胰岛β细胞特征和功能的细胞。Tang等发现，移植由MSCs诱导的β细胞可逆转糖尿病小鼠的高血糖血症。除骨髓来源的MSCs，脐带和脂肪来源的MSCs因获取容易，成为治疗1型糖尿病的新希望。近年来多项基于小鼠模型的研究发现，脂肪来源的MSCs 经诱导后可成为胰岛素细胞，并可在小鼠模型中正常分泌胰岛素除分化成类胰岛细胞外，MSCs还具有免疫调节功能。
MSCs 在免疫微环境中可以分化成两种表型，一种是促进炎症的MSC1，另一种是抑制炎症的 MSC2。MSC表型的转化和分化依赖于免疫微环境状态，在促炎免疫微环境中，MSCs 会释放吲哚胺2，3-双加氧酶、一氧化氮、前列腺素E2、转化生长因子-β等细胞因子，抑制T细胞增殖。
MSCs 对免疫微环境中的各种T细胞亚型有着广泛影响，正常生理条件下，胰腺组织中的辅助性T细胞(helper T cell，Th 细胞) 、调节T细胞以及细胞毒T细胞相互协调;
但在1型糖尿病的病理状态下，各种T细胞亚型的数量和功能发生异常。Li等研究发现，移植MSCs后Th1与 Th2细胞的比例降低，原始T细胞更多地分化成Th2细胞，从而抑制炎症反应。
此外，移植MSCs 也可抑制具有促进1型糖尿病炎症发展的Th17细胞，并抑制抗胰岛β细胞的细胞毒性T细胞功能，并且MSCs可以提高调节T细胞在体内的分化增殖，从而达到抑制Th1 和Th17细胞的作用。
总之，MSCs 移植可以干扰具有促炎症作用的效应T细胞，抑制自身免疫反应。以上是MSCs调控针对胰岛β细胞自身免疫炎症微环境的理论基础。MSCs 的免疫调节功能在多种来源的细胞中均存在，如脐带血来源的MSCs在体外培养可恢复T细胞等免疫细胞的免疫调节功能; Fiorina等研究发现，BALB /c-MSC 小鼠中MSCs表面的程序性细胞死亡配体-1 和血液中Th2细胞上调，提示脂肪来源的MSCs可能会抑制1型糖尿病患者的自身免疫失调。MSCs 来源较广，且兼具免疫调节和分化成产胰岛细胞的功能。
自体造血干细胞疗法
CD34阳性(CD34+)HSCs 是一种能够自我更新并分化为所有造血系细胞的干细胞，与 MSCs不同，自体HSCs移植的目的是改变患者异常的免疫系统状态，产生新的免疫细胞，替代针对胰岛β细胞产生抗体的B细胞或针对胰岛β细胞的T细胞和抗原呈递细胞，改善免疫系统环境，使新生或暂时丧失功能的胰岛β细胞得以生存和增殖。
研究发现，移植前对受体小鼠进行放疗清除骨髓原有细胞后再进行移植，来自供体的骨髓干细胞在受体内存活，替代被清除的异常免疫细胞，使胰岛β细胞存活，并最终使小鼠血糖正常化; 也有研究发现，注射骨髓来源的干细胞或者纯化后的 HSCs 后，在受体小鼠体内发现由供体干细胞直接分化成的胰岛素阳性细胞，提示HSCs不仅具有免疫调节功能，还具有分化功能。
因人类HSCs与小鼠HSCs在生物学特征和功能上有明显区别(如小鼠HSCs CD34的表达水平较低，而人类CD34的表达水平较高) ，移植人类HSCs后小鼠血糖正常化率没有直接在人体进行干细胞移植高，除在小鼠中获得成功外，其余实验或是没有得到移植有效的结果，或是发现 HSCs移植只能够改善小鼠的免疫环境并预防1型糖尿病，但对于已患有1型糖尿病的小鼠，单纯注射HSCs并不能逆转疾病。
综上，对于HSCs疗法的实验室模型和实验条件的选择还有待进一步研究探索，这对于如何筛选适合HSCs疗法的患者、优化治疗操作流程、提高治疗成功率有重要作用。
利用其他胰腺外细胞治疗
1型糖尿病除利用iPSCs、MSCs和HSCs等具有自我更新和分化能力的干细胞外，还可利用已经分化完成的细胞(如肝细胞、脾脏上皮细胞) 直接移植或在体外进行基因编辑后再移植。如通过基因编辑技术使肝细胞表达 Pdx-1、β胞素和神经D素后，肝细胞可转化成表达胰岛β细胞标志物的新细胞，并能分泌胰岛素。有报道称，给糖尿病NOD小鼠移植成人的脾脏细胞能够实现血糖的正常化，并在小鼠体内发现了正常的胰岛组织。但此研究结果并未在其他相似的研究中得到重复。有研究认为，小鼠体内恢复的胰岛组织实际上是宿主小鼠本身残留的β细胞。对于脾脏细胞在1型糖尿病中的作用还有待进一步研究。
干细胞治疗1型糖尿病临床进展
近年来，干细胞疗法已被广泛用于白血病、脑损伤、晚期肝硬化等疾病和自身免疫疾病的治疗。对于同样具有自身免疫疾病病理基础的1型糖尿病，干细胞疗法已在细胞和动物实验中取得了可靠的阳性结果，有关临床试验也在全球范围内逐步开展。目前 www.clinicaltrials.gov网站可以检测到的关于1型糖尿病干细胞疗法的相关临床研究已有53项，其中完成的且介入方式为干细胞移植的有7项( 表1) ，以HSCs和MSCs疗法为主。
干细胞治疗1型糖尿病已完成的临床试验归纳表
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治疗1型糖尿病前，HSCs疗法已被用于诸多自身免疫疾病的治疗，这些治疗案例为HSCs 疗法应用于1型糖尿病提供了治疗规范流程和经验。与动物实验一样，HSCs疗法的临床试验也未取得较为一致的阳性结果，但在人体中干细胞移植成功后的有效率却较动物实验高，这也体现了现有的小鼠模型并不一定适合 HSCs 疗法的临床前研究。有研究通过对23例1 型糖尿病患者进行前瞻性研究发现，接受自体非清髓性HSCs移植后，经7～58个月的随访，有20例患者长期或暂时性脱离外源性胰岛素治疗，其中8例复发，2例在使用西他列汀治疗后再次脱离了外源性胰岛素治疗，随访周期内所有患者均未发生糖尿病相关的严重并发症。
清髓性 HSCs移植疗法能够完全或部分解除患者对外源性胰岛素的依赖，恢复患者体内的免疫细胞和细胞因子水平，且未发生严重的并发症。由于HSCs疗法开展的时间较晚，治疗流程还未较好优化，所以并发症也较常见。虽然HSCs疗法有发生并发症的风险，但在移植过程中使用轻度到中度的免疫抑制方案，如环磷酰胺(总量2.0g /m2) 和氟达拉滨(总量120 mg /m2)能够有效避免重度并发症的发生，有效延长外源胰岛素非依赖状态的时间。
在一些HSCs移植失败的临床试验中并发症更为严重，如发热性中性粒细胞减少症、恶心、脱发，诱发自身免疫疾病，甚至严重的全身性感染，也有因移植造成的严重并发症而死亡的报道。因此，除提高HSCs疗法的有效性外，提高疗法的安全性也是重要的研究课题。
HSCs成功移植后也有可能对血糖调节无效。Malmegrim等认为，HSCs疗法的成功与否可能与患者的自身免疫状态有关。该研究发现，在HLA-A2阳性患者中，细胞毒性T细胞高反应患者在移植后24个月内因血糖控制不佳，需要重新使用胰岛素替代疗法治疗，而细胞毒性T细胞低反应患者血糖全部控制良好，无需额外补充外源性胰岛素。此外，在其他临床试验中也有证据表明血清内炎症因子的水平与患者预后相关，如血清白细胞介素-10、白细胞介素-4、转化生长因子-β、移植后禁食时C肽水平与HSCs 移植效率呈正相关，而血清肿瘤坏死因子-α水平及移植前胰岛素的使用量与移植成功率呈负相关。因此，在HSCs 移植前对患者免疫状态进行谨慎评估对移植术预后可能有重要影响。
相对于HSCs，目前MSCs 疗法已完成的针对1型糖尿病患者的临床试验较少。Carlsson 等将1型糖尿病患者分为移植组和对照组发现，70%移植MSCs的患者经过12个月的观察后，C肽释放试验应出现的峰值得以恢复，C肽的整体水平亦明显高于对照组，提示移植组患者的胰岛功能保留或明显恢复，且随访过程中未出现严重并发症。目前大部分注册的 MSCs 疗法的临床试验正处于进行和募集患者阶段。
以上已经完成的临床试验提示干细胞治疗1型糖尿病，随着更多以及更大队列研究的开展，干细胞治疗1型糖尿病的临床效果会被进一步展示，更成熟规范的治疗方案也会相继出现，从而提高患者的生存质量，减少并发症的发生。
小结
由于胰岛素替代疗法的局限性，1型糖尿病患者尤其是年轻患者急需新的治疗手段以减少并发症的发生，降低死亡率，并提高患者生活质量。近年来，干细胞移植治疗1型糖尿病在基础和临床研究中均取得了一定的进展，虽然目前还无法替代外源性胰岛素的作用，但逐渐增多的体外和体内研究为干细胞疗法的实际应用提供了可能，尤其是利用MSCs和HSCs治疗1型糖尿病取得了一定的进展。
目前参与治疗的患者人数较为局限，且没有统一的治疗程序和标准，但随着更多临床试验的开展，其研究结果将引导科研和医务工作者对此疗法进行更加深入的评估和思考。
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