聚焦药靶I NTRK靶点药物临床研究进展及伴随诊断解决方案
继FDA以加速批准程序方式批准了两款跨癌种的NTRK广谱抗癌药后， NTRK正在成为当下各制药企业研发管线中被寄予厚望的靶点，那么该靶点与肿瘤发生发展有何关联？目前NTRK药物临床试验进展情况如何？在精准医学时代，有效的伴随检测解决方案都有哪些？本期我们将聚焦NTRK靶点，围绕上述话题进行概述总结，同时分享已合作的各类NTRK药物临床试验信息，希望能为广大患者带来更多获益的机会，亦为药企伙伴提供药物临床试验的加速助力。
广谱抗癌药的诞生
自2015年以来，FDA已经批准了3款跨癌种的广谱抗癌药，其中的“拉罗替尼”和“恩曲替尼”都瞄准了同一个靶点：NTRK。
2018年11月26日，FDA以加速批准程序方式批准了Loxo Oncology Inc和Bayer的Larotrectinib（VITRAKVI，拉罗替尼），该药物可适用于具有神经营养受体酪氨酸激酶（NTRK）基因融合实体瘤且不含有已知获得性抵抗突变的儿童及成人患者[1]。
2019年8月15日，FDA又再次以加速批准程序方式批准了Genetech公司的Entrectinib（ROZLYTREK，恩曲替尼），该产品可适用于具有神经营养酪氨酸受体激酶（NTRK）基因融合实体瘤且不含有已知获得性抵抗突变的成人和超过12岁的儿童患者。同日，FDA还批准Entrectinib可适用于其肿瘤是ROS1阳性的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者[2]。
采用恩曲替尼进行治疗的目的被认为是“与组织无关的”，这意味着该药物可用于治疗任意具有NTRK基因融合的肿瘤类型，无论肿瘤是在机体的哪个组织发生的。这已经是继2017年FDA批准Keytruda（pembrolizumab）对具有特异性MSI-H生物标志物的患者进行治疗之后，第三款“与组织无关”的药物了[3]。
NTRK靶点概述
今天我们要了解的主要靶点是Trk（Tropomyosin Receptor Kinase）。Trk受体激酶家族是由三种蛋白（TRKA，TRKB和TRKC）组成的，在正常情况下，Trk家族的蛋白可被外周和中枢神经系统内的神经生长因子（NGF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经营养素3/4（NT-3/4）等活化，一旦被活化后，TRK信号即可通过三条主要的下游通路（RAS/MAPK/ERK，PLC-γ和PI3K）进行传递，从而影响神经细胞的分化和生存[4-7]。
Trk受体激酶家族的三种蛋白（TRKA，TRKB和TRKC）分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码。NTRK1基因的细胞遗传学定位于1q23.1，有17个外显子，基因全长约66Kb；NTRK2基因的细胞遗传学定位于9q21.33，有19个外显子，基因全长约358Kb；NTRK3基因的细胞遗传学定位于15q25.3，有19个外显子，基因全长约397Kb。
我们都知道核酸序列是不稳定的，有可能发生易位、倒位、缺失和交换，这样的突变往往会成为导致肿瘤发生与发展的最根本原因。对NTRK1/2/3基因而言，其约66Kb-400Kb的长度，使得与NTRK序列相关的基因融合成为了最常见的突变类型。而如此长的片段跨度、融合基因的多样性以及诸多内含子的存在，为NTRK靶点的准确检测增添了不少的困难。
NTRK靶点药物研发盘点
目前已经在成人和儿童的多种肿瘤中发现了不同频率的NTRK基因融合现象。在肺癌、大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和其他实体瘤或血液肿瘤中，NTRK的融合频率低于1%；在甲状腺癌、Spitzoid和胃肠道间质肿瘤中的融合频率为25%；在罕见肿瘤类型，例如分泌性乳腺癌、乳腺类似分泌腺癌(MASC)、先天性婴儿纤维肉瘤和细胞/混合的先天性中胚层肾细胞瘤中，其NTRK融合的频率可高至90%[6]。
即便在常见肿瘤中突变率较低，但因其具有跨癌种的普适性，NTRK正在成为当下各制药企业研发管线中被寄予厚望的靶点，截止到2020年7月24日，已有至少36项相关临床试验正在进行中，其中美国参与了26项，欧洲参与了11项，澳洲参与了7项，东亚地区参与了12项，中国参与了5项。（图中数字为各地区参与的项目数量，有的项目由多个地区参与，因此图中总数与36并不一致）
处于Phase 1和2的临床研究项目简况
NTRK靶点的不同检测方法介绍
与NTRK研发热度高度相关的话题是哪类患者才是该类药物的适宜目标人群？先决条件是看患者是否具有NTRK基因融合或其它突变，因此针对于NTRK的伴随诊断也成为此类药物能否让更多患者获益的重中之重。
目前NTRK的检测方法主要可以分为基于免疫组织化学方法（IHC），荧光原位杂交方法（FISH），以及基于核酸的逆转录PCR、基于DNA水平的二代测序、基于RNA水平的二代测序等分子生物学方法。
IHC方法的优势在于其对于样本载片的要求易于实现、成本优势以及快速的周转时限。但即使以商业化效果最好的EPR17341（Abcam）为例，其染色的深浅程度依然是不均一的，且其灵敏度和特异性也存在较大的波动[8-10]，尤其是对NTRK1/2和NTRK3的融合蛋白，灵敏度存在明显的差别[11]。
A为含有PLEKHA6-NTRK1融合突变肝内胆管癌的膜染色模式，B为含有典型ETV6-NTRK3融合唾液腺分泌性癌的细胞核和细胞质染色模式，C为含有LMNA-NTRK1融合的结肠腺癌的细胞质和核周染色模式，D为平滑肌，动脉壁的生理性染色，E和F分别为神经分化肿瘤，神经母细胞瘤(E)和胶质母细胞瘤(F)的生理性染色，这样的染色结果是难以进行解读的
FISH方法是广大临床实验室用来对实体瘤进行肿瘤融合基因检测的常用方法。其周转时限比IHC略长，对于制片和结果解读的要求也要略高于IHC。以ETV6基因为例，如果在婴儿纤维肉瘤、先天性中胚层肾瘤、唾液腺或乳腺等分泌性癌中要对ETV6-NTRK3融合基因进行检测，这样的方法是可行的[12]。但如果在其他癌种中要对NTRK基因的融合情况进行检测，仅有ETV6基因就会错过多种其他肿瘤基因的融合情况[13]。例如，LMNA-NTRK1融合是通过染色体之间的缺失形成的，这往往会在FISH的检测结果中呈现假阴性[14]。
由于NTRK基因融合涉及到多种融合片段和断裂方式，采用RT-PCR的方法来对这样的基因片段易位来进行检测是有一定的局限性的。再考虑到NTRK在绝大多数的正常组织中是不表达的，因此采用RT-PCR往往只能够获得间接的基因融合证据[15,16]。
基于DNA水平的NGS方法可以对来自于肿瘤的基因组DNA进行分析，从而同时对多个基因的体细胞突变状况进行评估。这样的评估可以从针对于肿瘤相关基因的小Panel到大Panel，进一步扩展到全外显子组，甚至是全基因组测序。但对于NTRK3这样外显子范围跨越200Kb以上、内含子区域含有高度重复序列的基因片段而言，目前还存在一定挑战[17]，需兼顾成本的同时，结合探针区域设计及生信算法等环节优化尽可能做到最佳的解决方案。而基于RNA的NGS方法则可以直接从FFPE提取RNA，然后进行cDNA的制备和测序。其优势在于能够对转录本的存在进行测定，从而鉴定出发生了融合到确切基因和外显子。当然FFPE载片中的RNA质量对于检测而言是非常重要的[14]，因此样本类型及质量将成为影响检测结果的关键。
最近科学报道还公开了从同一张FFPE片子中同时提取DNA和RNA的技术平台。在分别构建DNA和RNA文库之后，将两个文库合并起来进行测序。这种DNA/RNA杂交测序的方法可以在测序前对靶基因进行富集，从而更加容易对转录的融合基因进行检测[18]。
药物研发盘点
泛生子Onco PanScan（825Panel）
-基于DNA的NGS解决方案
泛生子一直致力于NGS的技术研发、肿瘤药物靶点检测及数据积累，早在2016年就已经开发出NTRK相关检测的NGS 多基因Panel，主要包括了NTRK1、NTRK2、NTRK3等TRK和临床用药指导相关基因，并于2018年结合指南、药物临床试验、科学研究发现等进展对产品进行了全面的优化升级，可实现在DNA水平对NTRK1/2/3进行精准检测。
亮点1：针对NTRK靶点的设计更加全面
结合公开研究资料，COSMIC，TCGA等权威信息和泛生子内部数据库，对NTRK靶点的设计，不仅包括了NTRK1/2/3的全外显子区域，还对部分内含子及NTRK3常见伴侣ETV6基因等均有覆盖。在探针方面，采用多重加密等公司Know-How技术进行设计。在生物信息学环节，则采用公司独有的融合变异识别算法，从而保证在DNA水平对NTRK靶点实现精准检测[18,19]。
亮点2：已在多个癌种中有效检出NTRK
至今泛生子已在肺癌、脑肿瘤、软组织肉瘤等多个实体肿瘤中检测到NTRK靶点多种变异类型的突变，随机抽样统计数据显示（近10000例实体瘤样本），NTRK总体检出率低于1%，在某些罕见肿瘤中检出率较高，而在肺癌、肠癌等常见实体肿瘤中检出率较低，基本趋势与公开文献报道非常接近，说明DNA水平检测的可靠性，以下为临床NTRK阳性检出结果的部分展示：
亮点3: 多项NTRK临床试验合作为患者提供更多机会
目前，泛生子已与国内外多个NTRK抑制剂药企开展广泛合作，致力于为患者提供更多获益可能，基于内部肿瘤大数据库及精准患者招募服务标准流程，已成功将多名NTRK阳性患者推荐入组到相关的临床试验项目中，未来希望随着NTRK药物研发进程的加快，中国患者能够尽早地收获到更多生存获益。
某患者NTRK融合变异结果示例
案例信息简述：该患者六年前被诊断为最为难治的三阴性乳腺癌，进行了手术治疗，2020年6月复发转移至肺部，进行白蛋白紫杉醇治疗后，产生严重的化疗不耐受反应，经泛生子Onco PanScan (825 Panel)检测其携带ETV6-NTRK3融合变异，且无其他靶药相关基因突变。现该患者已依据该检测报告成功入组NTRK药物临床试验，接受相应药物治疗，后续治疗情况正在持续跟进中。
目前可公开的泛生子合作NTRK药物临床试验招募列表
泛生子“黑科技”NTRK融合panel-
基于RNA的NGS解决方案
为满足药物临床试验的不同场景需求，泛生子目前已研发NTRK融合小Panel，可实现DNA＋RNA同时检测NTRK靶点的各种变异类型，包括点突变、小片段插入/缺失及融合，该Panel最大的亮点在于结合了TNA和Mutation Capsule技术，能够一次性的对微量样本实现已知融合和未知融合的精准检出，做到真正意义上的对患者不留遗漏的检测覆盖。
同时基于未来药物上市后，可为临床提供更多元化的检测选择角度出发，本Panel设计中同时覆盖了ALK、ROS1等多个肺癌、肠癌指南推荐检测的靶点基因，方便患者实现一次检测，获得多种用药指导的切实获益。该panel搭载泛生子已获批测序仪Genetron S5测序仪，未来可在医院端开展便捷、灵活检测，在5-7天内即可出具检测报告，为患者提供及时指导，争取更多治疗机会的可能。
NTRK与伴随诊断
伴随诊断（companion diagnostics，CDx）是一种与靶向药物相关的体外诊断技术，主要通过测量人体内蛋白、变异基因等的表达水平，了解不同患者对特定药物的治疗效果，能帮助医疗工作者评估不同患者的受益程度以及潜在副作用与风险，并确定最终治疗方案。
早在2014年8月，美国FDA就颁布了首版《体外伴随诊断试剂指导原则》[20]。目的旨在帮助各个公司在药物开发过程的早期阶段确定是否需要伴随诊断，并计划药物和伴随诊断测试的共同开发。本指南的最终目标是促进药物研发以及诊断方法研发的早期合作，从而使患有严重和危及生命的疾病的患者更快地获得有希望的新治疗方法。
从FDA已经批准的多款伴随诊断NGS产品来看，一个共同的趋势都是对于产品预期用途的限定都是非常具体的，且绝大部分都属于上市前许可类型（Premarket Approval Application，PMA）。因此，如果能够在靶向药物的研发流程中就加入相关伴随诊断的内容，往往可以提高临床试验的效率，缩短临床试验时间，对于医药研发企业和诊断试剂企业都具有重要的意义。从技术上来说，目前可用于NTRK伴随诊断的检测技术在上文中均已提及, 结合NTRK药物对靶点多种变异类型均可能起效的特征，基于NGS平台的NTRK检测正成为药物伴随诊断的主流解决方案。相信在不久的将来很快就会出现NTRK相关的伴随诊断产品，为广大患者带来生存获益。
参考文献（滑动）
1. FDA. FDA approves larotrectinib for solid tumors with NTRK gene fusions. 2018; Available from: https://www.fda.gov/drugs/fda-approves-larotrectinib-solid-tumors-ntrk-gene-fusions-0.
2. FDA. FDA approves entrectinib for NTRK solid tumors and ROS-1 NSCLC 2019; Available from: https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-approves-entrectinib-ntrk-solid-tumors-and-ros-1-nsclc.
3. FDA. New Drug Therapy Approvals 2019. 2020; Available from: https://www.fda.gov/drugs/new-drugs-fda-cders-new-molecular-entities-and-new-therapeutic-biological-products/new-drug-therapy-approvals-2019.
4. Vaishnavi, A., et al., Oncogenic and drug-sensitive NTRK1 rearrangements in lung cancer. Nat Med, 2013. 19(11): p. 1469-1472.
5. Passiglia, F., et al., The potential of neurotrophic tyrosine kinase (NTRK) inhibitors for treating lung cancer. Expert Opin Investig Drugs, 2016. 25(4): p. 385-92.
6. Cocco, E., M. Scaltriti, and A. Drilon, NTRK fusion-positive cancers and TRK inhibitor therapy. Nat Rev Clin Oncol, 2018. 15(12): p. 731-747.
7. Kummar, S. and U.N. Lassen, TRK Inhibition: A New Tumor-Agnostic Treatment Strategy. Target Oncol, 2018. 13(5): p. 545-556.
8. Gatalica, Z., et al., Molecular characterization of cancers with NTRK gene fusions. Mod Pathol, 2019. 32(1): p. 147-153.
9. Rudzinski, E.R., et al., Pan-Trk Immunohistochemistry Identifies NTRK Rearrangements in Pediatric Mesenchymal Tumors. Am J Surg Pathol, 2018. 42(7): p. 927-935.
10. Hechtman, J.F., et al., Pan-Trk Immunohistochemistry Is an Efficient and Reliable Screen for the Detection of NTRK Fusions. American Journal of Surgical Pathology, 2017. 41(11): p. 1547-1551.
11. Solomon, J.P., et al., NTRK fusion detection across multiple assays and 33,997 cases: diagnostic implications and pitfalls. Modern Pathology, 2020. 33(1): p. 9.
12. Connor, A., et al., Mammary analog secretory carcinoma of salivary gland origin with the ETV6 gene rearrangement by FISH: expanded morphologic and immunohistochemical spectrum of a recently described entity. Am J Surg Pathol, 2012. 36(1): p. 27-34.
13. Doebele, R.C., et al., An Oncogenic NTRK Fusion in a Patient with Soft-Tissue Sarcoma with Response to the Tropomyosin-Related Kinase Inhibitor LOXO-101. Cancer Discov, 2015. 5(10): p. 1049-57.
14. Solomon, J.P., et al., Identifying patients with NTRK fusion cancer. Annals of Oncology, 2019. 30: p. VIII16-VIII22.
15. Suehara, Y., et al., Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clin Cancer Res, 2012. 18(24): p. 6599-608.
16. Wang, L., et al., Identification of a novel, recurrent HEY1-NCOA2 fusion in mesenchymal chondrosarcoma based on a genome-wide screen of exon-level expression data. Genes Chromosomes Cancer, 2012. 51(2): p. 127-39.
17. Hsiao, S.J., et al., Detection of Tumor NTRK Gene Fusions to Identify Patients Who May Benefit from Tyrosine Kinase (TRK) Inhibitor Therapy. Journal of Molecular Diagnostics, 2019. 21(4): p. 553-571.
18. Yoshino, T., et al., JSCO-ESMO-ASCO-JSMO-TOS: international expert consensus recommendations for tumour-agnostic treatments in patients with solid tumours with microsatellite instability or NTRK fusions. Ann Oncol, 2020. 31(7): p. 861-872.
19. Marchio, C., et al., ESMO recommendations on the standard methods to detect NTRK fusions in daily practice and clinical research. Ann Oncol, 2019. 30(9): p. 1417-1427.
泛生子（纳斯达克代码：GTH）是中国领先的癌症精准医疗公司，专注于癌症基因组学研究和应用，并致力依托先进的分子生物学及大数据分析能力改变癌症诊疗方式。泛生子已打造了全面的产品及服务管线，覆盖从癌症早筛到诊断及治疗建议，再到监测及预后管理的癌症全周期。
4000-996-336
www.genetronhealth.com