泛谈-分子诊断 015 PCR技术

泛生子依托核心荧光定量PCR、数字PCR及高通量测序等平台提供分子诊断整体解决方案。现推出“泛谈-分子诊断”专栏，旨在与每一位致力于分子诊断应用发展的伙伴共同梳理技术发展脉络、探讨临床转化应用、推动检验发展，为更多病患提供精准诊疗方案。

近期主题我们将梳理分子诊断技术，主要围绕核酸定性&定量、常用检测技术等方向进行展开，今天我们讨论常见的检测技术：PCR技术。

中心法则

PCR技术发展史

在1953年沃森和克里克发现DNA双螺旋结构模型的基础上，1971年，Khorana等最早提出了PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”并第一个成功完成丙氨酸tRNA编码基因的合成。但由于当时基因序列分析方法尚未成熟且热稳定DNA聚合酶还未被发现，因此DNA体外扩增技术并未获得全面推广。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段体外成功扩增哺乳动物单拷贝基因，且1988年Saiki等将耐高温DNA聚合酶引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，最终实现了PCR技术的自动化，迅速推动了PCR技术的应用和普及。1989年，美国《Science》杂志把PCR列为十余项重大科学发明之首,将热稳定DNA聚合酶命名为“年度分子”。1993年， Mullis博士因PCR技术荣获诺贝尔化学奖^[1-5]。

PCR技术发展史^[1-5]

PCR技术原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），是一种用于体外放大扩增目的DNA片段的分子生物学技术。其反应体系是由4种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA、寡核苷酸引物和PCR反应缓冲液组成。

PCR反应周期包括三个阶段：模板DNA变性—引物退火—链延伸。

• 通过加热使模板DNA变性（通常>90℃）。

• 将两个合成寡核苷酸引物退火至变性模板DNA（这两个引物与目标DNA链上的序列互补，长度通常为20-25个核苷酸）。

• 子链在耐热DNA聚合酶催化下，从结合引物的3′端开始链延伸（链延伸发生在55℃和70℃之间）。

PCR扩增过程示意图^[6]

第一轮合成的产物是两条子DNA链，然后作为下一轮模板，再次由引物驱动子链合成。依此重复大约25-35次，使目标序列呈2n指数倍扩增。此过程在一个可编程的热循环器中进行，可控制循环中每个步骤的时间和温度。

PCR扩增原理视频

PCR技术分类及应用

PCR技术有着广泛的应用，不仅在基础研究方面，还包括医学诊断、法医学和农业科学等各大领域。目前为止，PCR技术可以分为三代，分别是普通PCR、荧光定量PCR（RT-qPCR）和数字PCR（dPCR）。

PCR技术分类示意图^[7]

随着PCR技术不断被改进，目前已发展出了更多基于PCR原理应用于商业化的技术，如：逆转录PCR（RT-PCR）、多重PCR、等温扩增PCR……，接下来几期我们将逐一讨论各项PCR技术。

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参考文献

[1] Watson, J. D. and F. H. Crick .Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid[J]. Nature. 171(4356): 737-738.

[2] Khorana, H. G.Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast[J]. Pure Appl Chem. 25(1): 91-118.

[3] Kleppe, K., et al.Study on polynucleotides: repair replication of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases[J]. J Mol Biol 56(2): 341-361.

[4] Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia[J]. Science. 230(4732): 1350-1354.

[5] Saiki, R. K., et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase[J].Science. 239(4839): 487-491.

[6]Michael R Green;Joseph Sambrook.Polymerase Chain Reaction[J].Cold Spring Harbor protocols.2019(2).

[7]Hanliang Zhu,Haoqing Zhang,Ying Xu.,et al.PCR past,present and future[J].BioTechniques.2020.69(4):317-345.

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