核酸提取——特殊DNA的提取方法

质粒的提取

细菌中的质粒是一类双链、闭和环状的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。质粒通常存在于细胞质中，其是独立于细胞染色体之外的、具有自主复制能力的遗传单元，通常情况下可持续稳定地在宿主细胞内复制并传代，质粒目前已成为最常用的基因克隆载体。

碱裂解法提取质粒DNA

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

碱裂解法具有快速、得率高、几乎无基因组DNA污染等特点，使用该方法所得的质粒DNA能够满足细菌转化、DNA片段酶切、常规克隆及标记等基本分子生物学实验的要求。

注意事项

1. 裂解液和菌体的比例，为了保证菌体的充分裂解从而达到最佳的提取效果，裂解液和菌体的比例十分重要，要按照实际的实验所需，确定所用菌体的量，之后根据试剂盒的推荐，选择合适的裂解液与菌体比例；

2. 蛋白质的沉淀，在4℃下蛋白质沉淀效率较高，因此，在加入Solution III后可在4℃静置一段时间并采用4℃离心，以提高蛋白质的去除效果；

3. 质粒的纯化，碱裂解法提取的质粒DNA不经其它纯化步骤就已经具有了较高的纯度，配合其它纯化方法，如氯仿/醇沉淀、吸附柱等，可以获得纯度很高的质粒；

4. RNA的去除，在Solution I 中加入RNase A (100μg/mL) 可以有效的去除RNA残留。

环境样本质粒DNA提取方法[1]

1. 应用FastDNA Soil Kit (MP Biomedicals) 提取环境样本的总DNA；

2. 应用QIAGEN Plasmid Mini Kit从总DNA中浓缩质粒DNA；

3. 应用ATP-dependant Plasmid Safe DNase对1μg浓缩后的质粒DNA进行处理，去除染色体DNA的残留；

4. 应用DNA Clean and Concentrator-column clean-up kit (Zymo Research) 去除质粒中残留的ATP，并浓缩质粒；

5. 应用3M sodium acetate (pH 7.0) 对质粒DNA进行沉淀；

6. 应用70%的乙醇清洗3遍，干燥后使用无菌水进行溶解；

7. qPCR方法测定质粒标志基因tetG在总DNA和浓缩质粒DNA中相对丰度的变化，评估质粒的浓缩水平；

8. qPCR方法测定16S rRNA评估浓缩质粒DNA中是否还存在染色体DNA污染。

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胞外DNA (eDNA) 提取

沉积物eDNA提取方法[2]

1. 2.5g沉积物与7.5mL 0.1M PBS (pH 8.0) 混合，加入0.5g acid-water PVPP；

2. 150r/min进行混匀，混匀1min，冰上冷却1min，进行3个循环；

3. 加入终浓度为1%的SDS，混合10s，冰上冷却后，500g、4℃离心10min，将上清液转移到新的离心管中；

4. 向沉淀中再加入7.5mL PBS，但是不加SDS，重复上述步骤2次，将所有上清液混合，10000g、4℃离心20min；

5. 取上清液过0.22μm滤膜，滤液与1%的CTAB (向50mL pH为8.0的Tris-10mM EDTA中加入1%的CTAB) 等体积混合，65℃温育30min；

6. 5000g、4℃离心10min，弃上清；

7. 向沉淀中加入适量的TE buffer以熔解DNA，再加入0.6倍体积预冷的异丙醇，冰上培育1h，10000g、4℃离心15min，弃上清；

8. 应用10mM Tris-HCl-0.1mM EDTA (pH=8.0) 重悬沉淀，加入等体积的phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1)，10000g、4℃离心5min；

9. 上清与chloroform-isoamyl alcohol (24:1) 等体积混合，10000g、4℃离心5min；

10. 上清液加入终浓度70%的乙醇和0.2M氯化钠，-20℃培育1h，10000g、4℃离心15min，应用乙醇清洗2次沉淀，室温晾干，之后用无菌水溶解。

水体中eDNA的提取方法[3]

核酸吸附材料制备：

1. 将25.2g三氯化铝缓慢溶解在4L的去离子水中；

2. 加入180mL 2mol/L的碳酸钠，并用1mol/L的碳酸钠将pH调至7.2；

3. 室温放置6-12h，之后1100g离心5min，弃上清；

4. 用1L 0.14mol/L的氯化钠重悬沉淀，1100g离心5min，弃上清；

5. 应用2L 0.14mol/L的氯化钠重悬沉淀，120℃灭菌20min；

6. 以体积比47.8%与5-6%的60-100目硅胶 (g/mL) 混合，60℃干燥36h。

吸附及洗脱：

1. 18g制作好的核酸吸附材料加入1.5×40cm的柱形玻璃管中；

2. 将10L水样以50mL/min流速通过此管；

3. 应用100mL洗脱液进行洗脱；

   洗脱液配方：15g/L氯化钠、30g/L tryptone、15g/L beef extract、3.75g/L GLY、0.28g/L氢氧化钠、pH9.0-9.5

4. 洗脱后的滤液过0.45μm PES滤膜；

5. 滤液与等体积的异丙醇混合，室温放置16h；

6. 10000g离心5min；

7. 应用70%乙醇清洗一次，室温放置5min，加1mL TE buffer溶解eDNA。

eDNA和iDNA的分离提取[4]

沉积物：

1. eDNA提取：

1. 1g干重沉积物中加入4mL磷酸二氢纳溶液 (0.12M，pH8.0) 和0.2g PVPP;

2. 混合液在250rpm、25℃下震荡10min;

3. 4℃下10000g离心10min，上清液应用0.22μm滤膜过滤，之后在冰上保存；

4. 向剩余的沉淀中加入4mL磷酸二氢纳溶液，按照上述步骤重复提取3次；

5. 上清液混合后在4℃下10000g离心20min；

6. 所有上清液混合后冰上保存，之后用CTAB法提取eDNA。

2. 将上述步骤得到的所有细胞沉淀混合后用于提取iDNA：


1. 将4mL DNA提取buffer和0.5g的1mm玻璃珠加入到细胞沉淀中，2500rpm下涡旋10min；
   DNA提取buffer配方：100mM Tris-HCl，100mM Na2-EDTA，100mM 磷酸三纳，1.5M NaCl，1%CTAB，50mg/mL蛋白酶K

2. 再加入1mL 10%的SDS，在液氮中冷冻1min，之后在60℃下培养20min；

3. 上述步骤重复3遍；

4. 在4℃下13000g离心20min，上清液在冰上保存；

5. 沉淀应用2mL DNA提取buffer重悬，2500rpm下涡旋5min，37℃培养2h；

6. 加入1mL的SDS，60℃培养20min，最后在4℃下13000g离心20min；

7. 所有上清液混合在一起应用DNA纯化试剂盒进行纯化。

水体样本：

1. 0.2L水体样本经过0.22μm滤膜过滤后在冰上保存，滤液在4℃下10000g离心10min；

2. 上清液根据沉积物方法提取eDNA；

3. 残留的细胞沉淀根据沉积物方法提取iDNA。

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噬菌体DNA提取[5]

1. 样品首先与PBS (pH 7.4) 以1:10比例混合，室温下磁力搅拌30min混匀；

2. 将混匀的悬浊液于4℃条件下10000g离心30min；

3. 上清液经过低蛋白结合的0.22μm滤膜过滤，去除细菌；

4. 之后滤液应用100kDa Amicon超滤膜进行超滤，浓缩噬菌体；

5. 浓缩后的噬菌体使用氯仿进行处理，去除含有DNA的颗粒物质；

6. 之后使用DNase (100U/mL) 处理去除噬菌体颗粒外部的游离DNA；

7. 处理完成后，在80S℃加热10min使DNase失活；

8. 之后加入蛋白酶K，10000g、4℃离心10min；

9. 上清中加入100%乙醇和3M乙酸钠至2mL；

10. 之后采用DNA Clean and Concentrator-column clean-up kit（Zymo Research）纯化，从而收集噬菌体DNA。

[1] Zhang, T., Zhang, X.X., Ye, L. 2011. Plasmid metagenome reveals high levels of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in activated sludge. PLoS One, 6(10), e2604.

[2] Corinaldesi, C., Danovaro, R., Dell’Anno, A. 2005. Simultaneous recovery of extracellular and intracellular DNA suitable for molecular studies from marine sediments. Appl. Environ. Microb., 71(1), 46-50.

[3] Wang, D. N., Liu, L., Qiu, Z. G., et al., 2016. A new adsorption-elation technique for the concentration of aquatic extra cellular antibiotic resistance genes from large volumes of water. Water Res., 92, 188-198.

[4] Mao, D., Lou, Y., Mathieu, J., et al., 2014. Persistence of extracellular DNA in river sediment facilitates antibiotic resistance gene propagation. Environ. Sci. Technol., 48(1), 71-78.

[5] Calero-Caceres, W., Melgarejo, A., Colomer-Lluch, M., Stoll, C., Lucena, F., Jofre, J., Muniesa, M. 2014. Sludge as a potential important source of antibiotic resistance genes in both the bacterial and bacteriophage fractions. Environ. Sci. Technol., 48(13), 7602-7611.

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基本分子生物学实验系列

• 核酸提取

• 特殊DNA的提取

• 核酸质量检测

• 琼脂糖凝胶电泳

• 微量分光光度计

• 目的基因PCR和克隆

• PCR技术的基本原理

• 引物设计和实验技巧

• 功能基因的克隆技术

• 荧光定量qPCR

• 荧光定量qPCR基本原理

• 绝对定量

• 相对定量

• 荧光定量qPCR的实验设计和体系优化

• 荧光定量qPCR仪器设置