Sci Adv | 卞迁/代杰文团队合作揭示颅颌面软骨发育过程中增强子的动态调控规律
增强子是在转录调控中发挥关键作用的非编码调控元件，其突变与很多复杂疾病的发生密切相关。哺乳动物的基因组中存在海量的增强子，在不同的组织，不同的发育阶段中，一个基因往往与多个潜在增强子相关联。增强子如何选择性地与目标基因建立调控关系，进而建立多样的基因时空表达模式，目前尚不明晰。
近日，上海交通大学医学院附属第九人民医院的卞迁/代杰文团队合作在Science Advances 杂志上发表了题为 Integration of 3D genome topology and local chromatin features uncovers enhancers underlying craniofacial-specific cartilage defects 的研究论文。该研究以关键转录因子Sox9位点为模型探究了发育过程中增强子使用的偏好性，发现染色质拓扑结构的差异可以导致活性相似的Sox9远端增强子在神经嵴来源的下颌软骨和中胚层来源的四肢软骨中行使不同的调控功能，这一发现是对现有增强子调控理论的重要补充，并为理解颅颌面发育缺陷的遗传学机制提供了线索。
SOX9作为在软骨、颅颌面及性腺发育中的重要基因,在不同组织中的表达受到精细的调控。人类SOX9基因上游1Mbp以外非编码区域发生的结构变异会导致皮埃尔-罗宾序列征（Pierre Robin Syndrome， PRS），其临床表现为下颌短小，而四肢发育不受影响，提示PRS区域特异调控SOX9在颅颌面组织中的表达。此前发表的一项研究（Long et al. 2020 Cell Stem Cell, PMID: 32991838）表明，人类PRS区域含有三簇颅颌面特异增强子，这些区域在颅神经嵴细胞中高度开放，但在颅神经嵴细胞分化为软骨细胞后开放性显著降低，提示这些增强子可能调控神经嵴的早期生长与分化，但在软骨中不再发挥功能。然而，在小鼠中敲除最强的颅神经嵴细胞增强子EC1.45对颅颌面发育仅有及其轻微的影响。PRS区域中是否还存在其它调控SOX9在颅颌面中表达的顺式元件尚不明确。
在本研究中，作者构建了敲除Sox9 基因远端长达278kb的PRS区域的小鼠模型（PRS -/-）。PRS-/-小鼠表现出明显的下颌发育不良，更好地模拟了PRS患者的表型。作者进一步分析了PRS-/-小鼠下颌发育不同阶段的Sox9表达水平，发现PRS区域的缺失导致神经嵴发育早期Sox9表达下调，有趣的是，在E14.5的下颌软骨 (MC) 中，PRS区域的缺失依然导致Sox9的显著下调，而前肢软骨（FL）中的Sox9表达不受影响。通过ATAC-Seq、H3K27Ac CUT&Tag等实验，作者发现小鼠PRS区域的增强子在神经嵴细胞中表现出高染色质开放性和H3K27Ac信号，但在软骨中这些信号显著减弱，这一模式与此前人类细胞中的报道高度一致。这些结果提示，尽管PRS区域的增强子在神经嵴分化为下颌软骨后活性显著降低，其仍然持续在Sox9的转录调控中发挥重要功能。
这种增强子活性与增强子调控功能的解偶联是如何发生的呢？利用Hi-C技术，作者解析了E14.5下颌软骨与前肢细胞的基因组三维结构。Hi-C结果显示，PRS区域在神经嵴来源的下颌软骨中与Sox9启动子通过长距离的染色质环相互作用，而这一染色质环在前肢软骨中并不存在。利用定量整合染色质互作频率，染色质开放性及H3K27Ac信号强度的Activity-by-contact (ABC) 模型，作者鉴定了多个潜在的Sox9下颌或前肢软骨特异增强子，并利用CRISPRi在下颌与前肢软骨原代细胞中对这些增强子进行了功能验证，最终确定位于PRS区域内，且靠近染色质环基座的Enh51为功能最重要的Sox9下颌软骨特异增强子。作者进一步将这一发现推广至全基因组，利用ABC模型鉴定了1万余个在下颌和前肢中行使差异功能的潜在增强子，并发现这些位点与下颌或四肢特异的骨发育异常显著相关。
综上，作者提出以下模型：在神经嵴发育早期，PRS区域内的多个增强子被特定转录因子激活，与此同时，PRS区域与Sox9启动子间的染色质环被建立。这一谱系特异性的染色质环在神经嵴分化为软骨细胞后持续存在，使得PRS区域内活性减弱的增强子在下颌软骨中仍然发挥显著调控功能。而在中胚层来源的四肢软骨中，这一染色质环未被建立，因而PRS区域的弱增强子不发挥显著的调控功能。这种由染色质拓扑结构导致的增强子使用偏好性是否是一种在发育中普遍存在的表观遗传特征有待未来进一步探究。
上海精准医学研究院卞迁研究员、上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科代杰文研究员为该论文的共同通讯作者；本论文的所有实验均由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科研究生陈启铭完成。
上海精准医学研究院卞迁课题组致力于揭示真核生物发育和衰老过程中染色质的结构与功能，课题组长期招聘对表观遗传学与染色质结构、增强子等非编码调控元件、胚胎与生殖系统发育等研究方向感兴趣的博士后和科研助理，有意加入者请联系 。
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