Cell：上海交大医学院团队解密单核细胞命运图谱丨CellPress对话科学家
组织定居的巨噬细胞（RTM）在组织稳态、炎症与组织重塑方面中有重要的作用，但RTM的来源及维持过程仍存争议 【2】。以往的研究认为巨噬细胞来源于血液中循环的单核细胞，近期的研究显示大多数RTM群体随着胚胎造血作用而在相应组织落脚，以不依赖于骨髓的方式进行自我维持【3】【4】。然而部分RTM需要接受血液单核细胞的补充，这群RTM与胚胎来源RTM的区别尚不明确。在稳态、炎症乃至疾病条件下，血液单核细胞对RTM补充的动态过程及细胞补充程度存在极大的争议。
近日，上海交通大学医学院Florent Ginhoux教授团队与苏冰教授团队在Cell Press细胞出版社旗下Cell（《细胞》）期刊以“Fate Mapping via Ms4a3-Expression History Traces Monocyte-Derived Cells”为题，发表了基于Ms4a3的全新单核细胞命运图谱分析系统，为深入探索特定单核细胞群体及RTM的功能提供了有力的支持。
（长按识别下图中的二维码阅读论文）
如今的研究正关注于成年造血作用对RTM的贡献。通过异种共生和细胞命运图谱分析等方法，研究人员发现巨噬细胞定居的组织存在一定的差异，并将其分为三类：无稳态单核细胞招募的关闭状态，如脑、上皮、肺和肝脏；稳态单核细胞快速招募的开放状态，如肠道和真皮；稳态单核细胞慢速招募的开放状态，如心脏和胰腺 【1】。研究人员推测组织微环境和性别等因素可能引起RTM在不同组织具有不同的更新方式，但其中的机制尚不明确。建立一种能够在各种条件下准确而有效地分析RTM来源的方法非常有必要。
Cx3cr1cre、Cx3cr1CreERT2和LyzMCre等现有的单核细胞命运图谱分析模型并不能够精准地将树突状细胞（DC）与RTM区分开 【5】。为建立能够精准揭示各种条件下单核细胞对RTM的贡献、并且区分单核细胞与DC的单核细胞命运图片分析模型，Ginhoux团队与苏冰团队首先对祖细胞进行单细胞测序并采用生物信息学技术筛选单核细胞特异性表达的基因。研究团队发现编码4域跨膜蛋白亚家族A成员3（Ms4a3）的特异性基因Ms4a3能够准确地追踪粒单核祖细胞（GMP）与单核祖细胞（cMoP），且不标记单核/树突祖细胞（MDP）与其DC后代。基于Ms4a3的表达特点，研究团队构建了Ms4a3TdT报告小鼠、Ms4a3Cre-RosaTdT细胞命运追踪小鼠和Ms4a3CreERT2-RosaTdT细胞命运追踪小鼠，借助这些工具鼠而探索单核细胞分化途径、研究不同组织、不同影响因素在稳态及炎症条件下对于RTM的影响。
Ms4a3在骨髓cMoP中特异性表达
过去的理论认为单核细胞的分化按照髓系祖细胞（CMP）→GMP→MDP→cMoP→单核细胞的顺序。近期的研究发现MDP直接由CMP分化而来，且GMP与MDP以相似的途径分别分化为不同的单核细胞。Ginhoux团队与苏冰团队的实验结果显示骨髓中GMP特异且短暂地表达Ms4a3，并分化为GP与cMoP；而MDP并非由GMP分化而来，亦不分化为cMoP，而是分化为CDP并进一步分化为DC。该结果进一步改写了以往的单核细胞分化理论。
为探索单核细胞对RTM补给的动态过程，研究团队采用出生后0-36周龄的Ms4a3Cre-RosaTdT小鼠分析脑、表皮、肝脏、肺和肠道等多种组织内tdTomato的标记水平。研究团队发现，在稳态条件下，单核细胞对RTM的贡献因组织而异，而且受小鼠性别的影响；在炎症状态下，单核细胞对RTM的贡献因炎症模型而异。
此项研究建立了基于Ms4a3的单核细胞命运追踪模型，构建了有效的Ms4a3TdT报告小鼠、Ms4a3Cre-RosaTdT细胞命运追踪小鼠和Ms4a3CreERT2-RosaTdT-诱导性细胞命运追踪小鼠，发现不同年龄条件下单核细胞在不同组织对RTM的贡献，揭示稳态与不同炎症状态下单核细胞对RTM的贡献，说明单核细胞可以填补巨噬细胞缺失的部位，并原地分化为单核细胞来源的巨噬细胞。此模型对于加深胚胎与骨髓来源的RTM的理解至关重要，对于研究稳态、炎症及感染、肿瘤和代谢病等疾病状态下的RTM功能有重要意义。
Ms4a3Cre-RosaTdT特异性标记GMP、GP与cMoP，并揭示不同组织中RTM的来源
针对此项研究，Cell Press细胞出版社邀请了论文通讯作者之一苏冰教授代表作者团队为大家进行解读。
作者专访
Cell Press：相比于Cx3cr1cre、Cx3cr1CreERT2和LyzMCre等其他单核粒细胞命运图谱分析系统,基于Ms4a3系统的优势体现在哪些方面？
苏冰教授：我非常高兴能代表我们团队尤其是同刘兆远博士一起来回答您的问题。
基于Cx3cr1和Lyz2的示踪系统在我们探索髓系细胞的过程中起到了非常重要的作用，极大的推动了该领域的发展。直到现在这些模型依然具有广泛的应用。但是，这两个示踪模型都没有解决单核细胞的发育和组织巨噬细胞的更新问题。基于Ms4a3的示踪系统在解决这些关键性问题上具有很大的优势。
基于Ms4a3的示踪系统的第一个优势在于它是在单核细胞发育的特定阶段标记单核细胞前体，在成熟的单核细胞中不表达，是严格意义上的谱系示踪。相比之下Cx3cr1和Lyz2则是在发育的后期才开始表达，并且在单核细胞中持续表达。因此，Ms4a3模型更适合研究单核细胞的发育过程。
基于Ms4a3的示踪系统的第二个优势在于能够区分胚胎来源的巨噬细胞和单核来源的巨噬细胞，这也是其最突出的优势。在Ms4a3-Cre系统中，单核细胞以及由单核细胞产生的巨噬细胞都会被标记上tdTomato红色荧光，而胚胎来源的组织巨噬细胞则不携带这些标记，通过简单的流式和显微成像技术就可以区分出不同来源的巨噬细胞。Cx3cr1-Cre和LyzM-Cre则无差别的标记不同来源的组织巨噬细胞。
基于Ms4a3的示踪系统的第三个优势是能够区分单核细胞和树突状细胞。Ms4a3-Cre标记97%的单核细胞，但是只标记低于10%的树突状细胞。Cx3cr1-Cre则标记大部分的单核细胞和树突状细胞。
综上，这三个优势使得Ms4a3模型更加适用于研究髓系细胞发育和功能。
Cell Press：此项研究建立基于Ms4a3的单核粒细胞命运图谱分析系统，并依此在稳态与炎症状态下对组织定居的巨噬细胞进行了分析，您认为此项研究可以对单核粒细胞发育与功能研究产生什么启发？
苏冰教授及刘兆远博士：遗传学上的示踪模型是研究细胞发育和功能的基础。既然我们可以示踪这些细胞，我们也可以在这些细胞中特异的敲除基因（Cre/LoxP），研究相关基因在单核-粒细胞中的作用。同时我们也可以操纵这些单核和粒细胞，在体内通过DTA/DTR系统敲除他们，从而研究这些细胞的发育和功能。因此，可以预见，Ms4a3单核-粒细胞示踪模型将极大促进单核-粒细胞功能的研究。
Cell Press：Ms4a3在单核粒细胞前体中的特异性表达是发掘该命运图谱分析系统的起始步骤，文章指出Ms4a3的发现依赖于生物信息学技术，您认为有效运用生物信息学技术解决免疫学问题的关键是什么？
苏冰教授及刘兆远博士：我认为这其中的关键是要对免疫学领域的前沿和关键科学问题有清晰的认识。技术是手段，科学问题才是关键。我们之所以运用单细胞测序和生物信息学技术去寻找单核细胞前体特异性的基因去构建示踪模型，是因为我们想去解决单核-巨噬细胞领域两个关键性的问题 ，1）在骨髓中，单核细胞是如何发育的？单核细胞、树突状细胞以及粒细胞在发育上的关系是什么；2）组织巨噬细胞是如何更新的？成体的单核细胞对组织巨噬细胞的贡献是怎样的。我们意识到解决这些科学问题的关键是单核细胞的示踪模型。因此我们决定通过单细胞测序技术寻找适合于构建单核细胞示踪模型的基因。然后通过单细胞测序和生物信息学技术，我们找到了Ms4a3。
Cell Press： 研究开展期间是否遇到一些困难，您和您的团队是如何攻克它们的？
苏冰教授及刘兆远博士：做发育学研究尤其是免疫细胞发育研究需要用到大量的测序和多色流式分析，对软硬件设施要求较高。刚开始的时候免疫所的流式平台只有BD CantoII和Calibur，无法同时分析十数个参数，测序工作更是只能依赖公司。得益于免疫所的平台升级，流式平台增设了2台Fortessa和一台Symphony，使得多色流式分析成为可能；测序平台从无到有，建立起了完善的测序和分析技术，可以进行微量测序和单细胞测序。平台的完善为我们克服了硬件设施上的困难。
在课题进展上，印象比较深刻的困难发生在研究工作刚刚开始的时候。当时我们刚得到Ms4a3-Cre的小鼠，我们将其与Rosa-EYFP的小鼠杂交，然后检测了该系统对单核细胞的标记情况。结果显示，Ms4a3-Cre；Rosa-EYFP系统只标记了5%左右的单核细胞，并没有达到我们的预期。如果这个时候我们放弃，那么后面可能也就没有这个模型了。后来，我们团队讨论后决定尝试另一个报告品系的小鼠Rosa-tdTomato，也就是我们文章中用的的报告品系小鼠。我们当时并不确定这样的尝试是否有意义，只是抱着最后的一丝希望去进行了尝试，结果喜出望外，我们成功标记了几乎全部的单核细胞（97%）和粒细胞（100%）。在此之后的进展就比较顺利了，没有遇到什么大的困难。回过头来看，如果当时我们放弃了，没有继续进行其他的尝试，那么我们可能就与这个单核细胞示踪模型失之交臂了。
Cell Press：基于此项研究发现的Ms4a3的单核粒细胞命运图谱分析系统，后续研究还有哪些工作将要进行？您的团队下一步的研究方向如何？
苏冰教授及刘兆远博士：Ms4a3单核细胞示踪模型的建立让很多以前没有办法进行的研究成为可能。在这篇文章中，我们主要研究了单核和巨噬细胞的发育问题，对功能的关注较少。后续我们的工作包括：1）分析不同来源组织巨噬细胞（tdTomato-胚胎来源的巨噬细胞 VS tdTomato+ 单核细胞来源的巨噬细胞）在转录组、表观组学和功能上的差异。2）我们的部分研究工作将会放在肿瘤上。肿瘤组织中有大量的巨噬细胞，这些巨噬细胞的来源以及不同来源的巨噬细胞的功能将会是我们的研究方向。3）我们的部分工作还将深入研究肠道巨噬细胞不同亚群的来源和功能。已有文献报道肠道中存在不同类群的巨噬细胞，这些不同类群的巨噬细胞有着不同的来源和更新速率。我们将探讨巨噬细胞不同更新速率背后的机制。
Cell Press：请您以学者的身份，谈一谈对年轻科研人员的建议。
苏冰教授：我相信，多年之后当人们回首二十一世纪前后的几十年，一定会发觉这是生命科学的黄金时代之一。在这前前后后的几十年中，人类在生物学上做出了许许多多重要的发明和发现，PCR技术、克隆技术、iPS技术、光遗传学、肿瘤免疫疗法以及举足轻重的基因编辑技术，人类探索生命、改造生命的能力得到了空前的发展。这是一个生命科学大发展的时代，依然有很多未知等待探索，依然有很多可能等待实现。我真心希望我们的年轻科学家能够以饱满的热情加入到生命科学的科研大潮中，如果你选择了生命科学，即使现在身处逆境有些低落，不要怀疑你的选择，毫无疑问，二十一世纪一定会是生命科学大放异彩的世纪。可能很多年轻的科学家在科研的道路上会遇到些挫折，会感到迷茫，会有些动摇，但这只是表明你在攀登比别人更陡峭的山，更险峻的路，而这些山这些路是提升自我最快的途径。“书山有路勤为径”，勤奋无疑是从事科研工作的最基本的要求。我所认识的那些杰出的科学家，他们不止聪明，更比绝大多数的人都要努力。做科研有时并不需要“超世之才”，但一定要有“坚忍不拔之志”，一定要有抗打击能力，科研是一个探索的过程，很多的尝试都可能不会成功。面对这些挫折，一定要在最绝望的时候依然能够咬牙坚持下去。
对于年轻的科学家的一些建议是：
选择一个自己想要探索的科学问题，然后义无反顾的去解决它；
潜心自己的研究内容；
拥抱新技术，将新技术应用到解决领域内关键性的科学问题；
善于合作和交流，和领域内最顶尖的科学家交流，碰撞出创新和灵感的火花；
开放思想，能够包容新的事物。有一个开放的思想对于创新和突破是至关重要的。
我希望我们年轻的科学家能够对科研留一份热情，对名利存一份淡泊。能够用更高更远的眼光去看待自己所从事的探索事业。“遇逆境不忘希望，遇鲜花不违方向”（陈国强院士语）沉下心来，不畏困难，不忘初心，曙光就在前方。
论文主要作者介绍
关于 Florent Ginhoux 教授
Florent Ginhoux教授系新加坡免疫学联网SIgN高级研究员。2015年4月正式担任上海市免疫学研究所客座教授并组建独立实验室，2016年入选第五批“上海高端人才计划”。目前，课题组包括2位研究助理、2位博士后、中以联合培养博士生1人、联合指导硕士研究生1人。
关于 苏冰 教授
苏冰教授现任上海交大医学院免疫学与微生物学系系主任，上海市免疫学研究所所长，美国耶鲁大学医学院免疫生物学系客座教授，上海交通大学王宽诚讲席教授，教育部长江学者讲座教授和中组部“国家高端人才计划”学者。苏冰教授课题组的主要研究方向是信号转导、肠道免疫和炎症相关疾病研究、血管生成机制及血管相关疾病研究。课题组聚焦丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，研究其在免疫反应和血管发育及功能中介导的生物学功能和意义，以及在调节细胞生长、细胞分化和细胞凋亡中的作用。苏冰教授至今已在Cell、Nature Genetics、Nature Immunology、Immunity、Mol Cell、Nature Cell Biol、EMBO J、Cancer Discovery和Nature Communications等发表高水平研究论文。
个人主页：
http://sii.shsmu.edu.cn/DetailMemberInfo.php?pid=6&cid=22&num=22&id=10
关于 刘兆远 博士
刘兆远博士本科毕业于山东师范大学，2015年博士毕业于上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所，同年底作为博士后加入本文章的通讯作者Florent Ginhoux教授在上海市免疫学研究所刚建立的实验室工作至今。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell（《细胞》）上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
论文标题：
Fate Mapping via Ms4a3-Expression History Traces Monocyte-Derived Cells
论文网址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30897-9
DOI:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.009
本文参考文献
1. Ginhoux, F., & Guilliams, M. (2016). Tissue-Resident Macrophage Ontogeny and Homeostasis. Immunity, 44(3), 439-449. doi:10.1016/j.immuni.2016.02.024
2. Ginhoux, F., & Jung, S. (2014). Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol, 14(6), 392-404. doi:10.1038/nri3671
3. Hoeffel, G., & Ginhoux, F. (2015). Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol, 6, 486. doi:10.3389/fimmu.2015.00486
4. van Furth, R., & Cohn, Z. A. (1968). The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. J Exp Med, 128(3), 415-435. doi:10.1084/jem.128.3.415
5. Yona, S., Kim, K. W., Wolf, Y., Mildner, A., Varol, D., Breker, M., . . . Jung, S. (2013). Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity, 38(1), 79-91. doi:10.1016/j.immuni.2012.12.001
推荐阅读
点击“阅读原文”，查看论文原文