Immunity：吕奔团队解密细菌感染诱发凝血反应机制丨CellPress对话科学家

凝血不仅对于机体稳态有重要作用，在抗感染和清除致病菌的固有免疫应答方面亦有重要意义。革兰氏阴性菌细胞膜的成分——脂多糖（LPS）等细菌内毒素，能够促进纤维素在感染部位沉积，是广为人知的凝血级联反应激活剂 【6】【7】【8】。在内毒素血症与革兰氏阴性菌败血症情况下，凝血级联反应的外源性激活会引起弥散性血管内凝血（DIC）。这种致命的凝血反应极大地增加了败血症的死亡率，使其成为临床主要致死原因之一 【3】。近期的研究发现磷脂酰丝氨酸的暴露与凝血反应有关 【4】，但这其中的机制尚不明确。

2019年12月，由中南大学湘雅三医院吕奔教授团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Immunity（《免疫》）上以“Bacterial Endotoxin Activates the Coagulation Cascade through Gasdermin D-Dependent Phosphatidylserine Exposure” 为题，阐述了Caspase-11及其酶切底物—Gasdermin D（GSDMD）在细菌感染诱发DIC过程中发挥的关键作用，揭示了革兰氏阴性细菌诱发DIC的分子机制，为今后脓毒症DIC的防治提供了新的思路。杨新宇博士和博士研究生程晓烨为该论文的并列第一作者；吕奔教授为该论文的通讯作者。

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细菌内毒素激活的凝血级联反应为外源性激活的凝血反应，其可以导致弥散性血管内凝血（DIC），这种致命的凝血障碍能够进一步诱发多器官衰竭【3】。半胱天冬酶11（Caspase-11）作为胞内LPS受体，是革兰氏阴性菌感染固有免疫应答的重要成分。经LPS激活后，caspase-11将消皮素D（GSDMD）剪切为成孔多肽【1】【5】。GSDMD孔进一步引起细胞焦亡、释放白介素1α（IL-1α）等警报素，或者使细胞保持在活跃状态、分泌白介素1（IL-1），后者并不导致细胞死亡 【2】【10】。已有研究发现在内毒素血症和败血症小鼠模型中，激活的caspase-11与机体死亡有关，但这其中的机制尚不明确。吕奔团队推测caspase-11信号可能在LPS-介导的外源性凝血反应中具有重要功能。

GSDMD介导的细胞PS外翻及提升促凝血活性机制模式图

通过比较野生型与Caspase-11缺失小鼠在LPS诱导后的凝血反应，研究团队发现LPS诱导的凝血级联反应的外源性激活由Caspase-11信号介导。Caspase-11信号不仅可以通过GSDMD引起细胞应答，还可以诱导缝隙衔接蛋白1的切割，从而激活嘌呤受体P2X7 【9】。为明确LPS诱导的凝血反应中Caspase-11信号的下游通路，研究团队分别采用Gsdmd缺失和P2x7缺失的小鼠，通过DIC指标比较LPS诱导后凝血反应的情况。Gsdmd缺失的条件下，抗凝血酶复合物（TAT）、纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）与血小板激活水平均显著降低，而P2x7缺失不改变LPS引起的凝血反应，这说明Caspase-11介导的LPS激活凝血级联反应通过GSDMD，而非P2X7。

内毒素诱导的凝血活化主要是依赖GSDMD而并不依赖P2X7

组织因子（TF）是一种跨膜糖蛋白。当通过结合因子FVII/FVIIa暴露于血液时，TF可以激活凝血级联反应 【4】。LPS的刺激能够增加髓系细胞和内皮细胞中TF的表达，而TF表达的下调或其功能的抑制则可以阻止内毒素诱导的DIC 【6】【7】。同时，TF的激活受转录后水平的调控，如细胞膜外叶的磷脂酰丝氨酸显著增强TF的活力。近期研究发现败血症显著增加免疫细胞表面的磷脂酰丝氨酸水平，这些磷脂酰丝氨酸的中和则显著减弱败血症的凝血情况 【4】。然而，人们对细菌感染的检测与败血症中磷脂酰丝氨酸的暴露之间如何联系知之甚少。

为研究GSDMD在内毒素血症中激活凝血级联反应的机制，吕奔教授团队对Gsdmd缺失的内毒素血症小鼠模型中TF功能与表达水平进行检测，辅以磷脂酰丝氨酸结合蛋白（MFG-E8）的处理，发现GSDMD通过促进磷脂酰丝氨酸而增强TF的激活。采用来自Caspase-11缺失与Gsdmd缺失小鼠的巨噬细胞进行体外LPS诱导实验的结果进一步说明，GSDMD通过磷脂酰丝氨酸而促进TF的激活。GSDMD孔为钾离子与钙离子（Ca2+）提供了跨膜转运通道。研究发现当减少细胞培养基中的Ca2+浓度，磷脂酰丝氨酸水平与TF激活状态均降低；而Ca2+载体对Ca2+的回补则显著增加磷脂酰丝氨酸的外翻和TF活性。跨膜转运蛋白16F（TMEM16F）是Ca2+依赖的磷脂酶，其可以在Ca2+内流时介导磷脂酰丝氨酸外翻。通过小干扰RNA在细胞中敲低Tmem16f的水平等实验，研究人员发现GSDMD通过介导Ca2+内流而发挥其促凝血功能，并且TMEM16F参与此过程。

GSDMD促进磷脂酰丝氨酸外翻而调控凝血反应

GSDMD活化的标志物与白细胞PS外翻及DIC相关指标呈密切相关

综上所述，在败血症条件下，GSDMD的激活能够调节IL-1α与白介素1β（IL-1β）的分泌。研究团队发现GSDMD激活的生物标记与败血症患者体内DIC的病程发展显著相关，进一步强调GSDMD激活对于DIC的作用。本项研究深入探讨了Caspase-11-GSDMD在败血症中的功能及机制，并为临床败血症与内毒素血症的诊断及治疗提供了新的思路。

Cell Press细胞出版社特别邀请论文的作者吕奔教授进行了专访，请他们为大家进一步详细解读。

作者专访

Cell Press：此项研究发现消皮素D（GSDMD）在半胱天冬酶11（caspase-11）介导的LPS引起的凝血级联反应中的功能，请问您是如何想到从caspase-11和GSDMD入手开展研究的？

吕奔教授：细菌感染诱发DIC是临床上危及患者的重症状态，能显著增加脓毒症的病死率。其发生的机理尚不甚清楚，在临床上也缺乏特效的治疗方法。结合我们课题组的前期发现——HMGB1-Caspase-11途径在重症细菌感染（脓毒症）中发挥关键的作用，我们推测该途径的异常活化可能为脓毒症DIC形成的关键机制，并开展该项研究。

Cell Press：研究开展期间是否遇到一些困难，您和您的团队是如何攻克它们的？

此项研究发现caspase-11的缺失、Gsdmd的敲除、磷脂酰丝氨酸或组织因子（TF）的中和均可以阻止LPS诱导的弥散性血管内凝血（DIC），您认为此项研究可以对DIC的临床研究提供哪些启发？。

吕奔教授：虽然我们研究团队成员熟悉凝血相关实验技术，但是该课题实施过程中我们确实曾遇到过不少困难，比如缺乏关键实验小鼠和特异性中和抗体。所以我们课题组与国内外相关实验室合作，如美国著名血栓与止血专家北卡罗来纳大学教堂山分校的Nigel Mackman教授为我们提供关键实验小鼠特异性中和抗体。此外，厦门大学的韩家淮老师和北京生命科学研究院的邵峰老师也为本研究提供了系列重要的转基因小鼠和细胞系。

DIC是一种临床综合征，据文献报道约有10%-60%脓毒症患者并发DIC或不同程度的凝血功能障碍，过去我们的DIC研究都是局限在炎症及凝血相关指标的检测和探索，机制研究报道并不多。以GSDMD为中心的巨噬细胞激活诱导促凝血活化机制的发现是感染，免疫与血栓三大领域的交叉点。以GSDMD为靶点的研究可能为今后临床DIC早期诊断、治疗提供新的思路。

Cell Press：Caspase-11介导的细胞焦亡通过释放白介素1α（IL-1α）和白介素1β（IL-2β）而激活机体抗细菌免疫应答。此项研究发现激活机体对LPS引起的凝血级联反应的并非细胞焦亡，而是caspase-11和GSDMD通过介导钙离子内流，您认为此项研究对机体抗细菌免疫应答有何启发？您的团队为此研究运用了什么创新的技术？

吕奔教授：在本研究中，我们发现caspase-11-和gsdmd介导的钙内流而非焦亡激活了LPS引起的凝血级联。GSDMD孔道是活细胞中IL-1家族细胞因子分泌的管道，这个过程被称为巨噬细胞的超活化。我们发现，活细胞膜表面的GSDMD孔道还能通过钙内流启动凝血反应。凝血反应是先天性免疫系统防止病原体随血循环播散的重要手段。然而，当局部细菌感染升级为全身性感染和脓毒症时，这种免疫血栓反应将变得广泛和失控，并发展为危及生命的DIC。

为了动态观察DIC形成的过程，我们首次应用活体共聚焦成像技术（转盘共聚焦和双光子共聚焦活体显微成像技术）直观、清晰和动态的展现了细菌内毒素导致DIC的病理生理过程。

Cell Press：基于此项研究的发现，后续研究还有哪些工作将要进行？您的团队下一步的研究方向如何？

吕奔教授：还有一些问题需要进一步的探索解决。比如Caspase11和GSDMD在脓毒症DIC形成中发挥了重要作用，那么体内何种细胞（血细胞或内皮细胞）表达的Caspase11和GSDMD发挥了主要作用？此外，我们发现阻断钙离子内流并不能完全抑制凝血活化，提示还有其它机制参与磷脂酰丝氨酸外翻及凝血活化。

Cell Press：请您以学者的身份，谈一谈对年轻科研人员的建议。

吕奔教授：第一：注重创新，要敢于探索，敢于质疑，同时结合自身实践，着重解决相关领域迫切需要解决的重要问题。第二：注重科研团队建设。科研过程中总会遇到这样或那样的困难，所以需要团队成员分工合作，相互配合。第三：注重合作。虚心向相关领域的前辈学习，并注重跨学科、团队、单位和国家的合作。

本文参考文献 （上下滑动查看）

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论文通讯作者介绍

关于 吕奔 教授

吕奔，中南大学湘雅三医院教授、主治医师、副院长，长期从事脓毒症与凝血病的基础理论研究、转化医学研究和临床一线工作，是国家青年973首席科学家、国家优青和全国青年岗位能手标兵，围绕脓毒症的发病机理开展了系列原创性研究，发现了“HMGB1-caspase-11途径的过度活化是导致脓毒症DIC和多脏器衰竭的重要病理生理机制”，完善了疾病的“炎症学说”，被邀请在美国冷泉港实验室iDEAs论坛等重要国际学术论坛上作主旨报告，担任美国休克学会组委会成员（共9人，亚洲唯一）和第42届美国休克年会分会场主席，以通讯作者身份在Nature、Immunity（2篇）、Nature Communications和PNAS等杂志上先后发表了系列有影响力的学术论文。

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Immunity上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

论文标题：

Bacterial Endotoxin Activates the Coagulation Cascade through Gasdermin D-Dependent Phosphatidylserine Exposure

论文网址：

https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(19)30463-7

DOI:

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.11.005

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