樊春海课题组以框架核酸为模板精确控制磷酸钙矿化丨CellPress对话科学家

自然界衍化出了以蛋白框架为代表的模板结构，用于引导生物矿化过程，生成各种复杂、精巧的生物硬组织。尽管过去十年，生物矿化及仿生矿化领域有长足的进展，如仿生贝壳结构的构建，但是设计程序可控的仿生矿化方法仍面临诸多困难，比如磷酸钙（CaP）的矿化过程就受到无法精准控制形貌和缺乏普适性方案的限制。

近日，上海交通大学化学化工学院樊春海院士团队提出了一种解决思路：即利用框架核酸作为模版，以静电相互作用为驱动力，制备具有规定形貌的矿化CaP纳米晶体。该工作以“DNA Framework-Encoded Mineralization of Calcium Phosphate“为题，发表在Cell Press旗下的Chem期刊上。

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在众多生物矿物中，作为人体骨骼和牙齿主要无机组分的磷酸钙（CaP），其合成与结构设计倍受研究者亲睐。但由于存在非经典成核过程及复杂的相组成与变化，使得合成精细的CaP纳米结构困难重重。樊院士研究团队利用框架核酸为模版来诱导CaP纳米晶体的矿化过程，成功地按照预设形貌制备出相应的几何结构，并因为CaP外壳的保护作用，使得DNA的环境耐受性得以增强，进一步拓宽了DNA纳米结构的应用领域。近年来，樊院士团队在以框架核酸为模版制备固态纳米结构，提高生物分子的稳定性，并在活细胞分析和传感器构建等方面开展了一系列优秀的工作。

以DNA框架为模板的CaP晶体生长和结晶过程受抗衡离子浓度和反应时间的控制。首先，研究团队使用广泛使用的20个碱基对（bp）的DNA四面体（TDN）作为模板来诱导CaP的矿化过程。先将5 mM的CaCl2溶液滴加到TDN的磷酸氢钠溶液中，获得含有4.0 μM TDN, 2.0 mM游离Ca2+和1.2 mM PO43-的溶液。将混合物在37 ℃下陈化3 h以形成CaP纳米晶体，整个矿化设计过程如图1所示：

图1：DNA框架为模板的CaP矿化过程

研究团队使用透射电子显微镜（TEM），低剂量场发射扫描电子显微镜（Low-dose FESEM）以及原子力显微镜（AFM）来表征CaP纳米晶体的形貌和尺寸分布，利用同步辐射小角X射线散射（SAXS）和分子动力学模拟（MD）来阐述CaP的结晶过程。在晶体生长初始阶段，首先形成CaP纳米簇，随着Ca2+浓度增加，聚合态纳米簇包裹在TDN周围形成中空的纳米粒子，得到无定型CaP纳米粒子（ACP），然后ACP经过熟化、结晶过程最终形成CaP纳米晶体。50 ns的MD模拟表明，静电相互作用的存在，使得Ca2+, PO43-, OH-紧密围绕在TDN模板周围（图2C）。并且当自由Ca2+浓度从0.0 mM增加到0.5 mM，回转半径值的增加和散射谱线的蓝移现象表明，在生长初期，TDN-CaP复合结构其四面体构型仍保持不变（图2D）。

图2 A 20 bp TDN初始阶段的SAXS实验及拟合曲线；B 20 bp TDN原始和修正结构的顶视图和侧视图；C 20 bp TDN诱导预成核团簇聚集的分子动力学模拟图；D TDN外周CaP团簇引起的散射位移（实验和模拟图）

为验证以DNA框架为模板且结构可编码的CaP矿化诱导策略的通用性，樊教授团队将这一理念拓展至DNA折纸（DNA origami）结构。团队在合成过程中发现最终生成的结构并不是沿着CaP的择优生长方向c轴方向生长，而是受限于DNA的几何结构之内。以DNA三角折纸为例，结合AFM多通道数据和HRTEM表征，团队发现在晶体的最初生长阶段，ACP簇倾向于在三角形尖端聚集，随着CaP进一步生长，矿化区域开始沿着三角形的边界延伸，最终填满三角形的中间孔洞（图3E和3F）。快速傅里叶变换（FFT）数据表明，尖端区域展现出单晶特点，而中间区域则由多晶组成。另外，DNA碱基对之间的距离为3.4 Å，与CaP晶体沿c轴方向的晶面间距相等，团队推测这一现象可能从原子层面揭示DNA在CaP结晶过程中发挥限制作用的原因。

图3 A 以DNA框架为模板的DNA折纸矿化过程示意图；B 三角形和方形DNA折纸矿化前后AFM形貌图；C AFM中不同结构的高度及特征尺寸统计分布图表；D DNA origami-CaP纳米晶体的明场像、高角环形暗场像以及能谱图；E DNA origami-CaP纳米晶体生长过程中5\10\15 min的AFM高度通道和相通道数据；F DNA origami-CaP纳米晶体生长示意图和单晶尖端与多晶中心电镜图

樊院士团队使用巨噬细胞RAW 264.7来验证以DNA框架为模板的CaP矿化结构在活细胞药物转运方面的适用性。胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤（CpG）基序寡脱氧核苷酸（ODNs）是一种具有强免疫刺激特性，能够发挥治疗作用的核苷酸，但其低的细胞摄取效率和差的细胞内稳定性限制了其功效在细胞内的发挥。团队使用CpG修饰的DNA四面体作为模板制备TDN-CpG-CaP纳米结构，用Cy3荧光团修饰CpG的3’末端，通过检测荧光强度和肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达水平来表征不同结构在活细胞中的特性。首先，所制备的TDN-CpG-CaP几乎没有细胞毒性（图4C），通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）和荧光激活细胞分选系统（FACS）检测发现，在相同DNA用量条件下，矿化后的TDN-CpG-CaP荧光强度高于未矿化的TDN-CpG（图4D），证明细胞对CpG的摄取率提升；进一步检测肿瘤坏死因子（TNF-α）的分泌情况，发现TDN-CpG-CaP的免疫刺激活性显著高于TDN-CpG。特别的，在48h后，未矿化的TDN-CpG的TNF-α分泌量已降至背景值，而TDN-CpG-CaP仍在有效刺激TNF-α的分泌（图4E）。结合之前的研究，团队认为CaP所包裹的纳米粒子进入细胞后，通过微管介导转运进入溶酶体，CaP外壳在酸性环境（pH ~ 5.5）中溶解，释放出TDN-CpG。这种后溶解策略能够使得核苷酸在复杂细胞内环境得到保护，并为制备具有规定的几何结构且长时间保持活体生物活性的药物转运载体提供了一种值得借鉴的思路。

图4 A TDN-CpG-CaP和TDN-CpG的合成示意图；B TDN-CpG-CaP和TDN-CpG结构的AFM图；C 不同结构的细胞毒性；D 细胞对不同结构摄取效率；E 不同结构的免疫刺激活性

文中指出DNA磷酸骨架与Ca离子之间的亲和性以及可编码的DNA结构是控制CaP矿化以获得规定几何结构的关键，并且CaP外壳不仅可以保留框架核酸的结构信息，也能够作为保护层增加功能性核苷酸在细胞内的转运效率。团队认为，只要化学反应条件满足框架核酸的耐受范围，这种策略就有希望应用于诸如碳酸钙和金属氧化物等具有光学、电学和磁特性的众多无机材料的结晶控制中。

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者樊春海院士进行了专访，请他为大家进一步详细解读。

作者专访

Cell Press：请樊院士简述仿生构建生物矿物过程中的困难，以及您的团队是如何克服这些困难？

樊春海院士：这项工作开展总体比较顺利，但是很多合作者在我们遇到困难的时候，给予了很大帮助。

样品的表征是最大的困难。一开始我们很难使用扫描电镜表征DNA四面体诱导的磷酸钙晶体，常规加速电压下样品很快被破坏。后来在上海硅酸盐研究所分析测试中心的帮助下，我们将加速减压降低至350V，并配合减速电场，终于较清楚的观察到磷酸钙四面体表面结构。类似的，在上海交通大学分析测试中心的帮助下，我们完整获取了整颗磷酸钙三角的原子相数据，为解释框架核酸诱导磷酸钙晶体生长的机理提供了重要证据。

另外，阐释框架核酸与结晶组分的相互作用机理也是主要困难之一。在美国凯斯西储大学杨泗春教授的帮助下，我们建立了针对框架核酸稀溶液体系的同步辐射小角X射线散射数据分析处理计算方法，为解释晶体生长的早期过程提供了证据。

Cell Press：文中构建了基于DNA分子框架的矿化磷酸钙体系，能够作为纳米试剂进行活细胞的药物转运，请问樊院士，这一研究成果在临床领域有何指导意义？

樊春海院士：我们课题组之前证实了框架核酸相较DNA双链具备更高的穿膜能力。然而，框架核酸的体内稳定性仍然是制约其功能发挥的主要因素之一。磷酸钙药物递送体系是一种常用的药物控释方法。得益于其与人体硬组织（骨，牙）无机组分的高度相似性，这类药物载体具有优异的生物相容性和可控降解能力。我们的研究则在传统球形磷酸钙载体的基础上，展示了框架核酸几何结构信息在磷酸钙晶体矿物中的可传递性。这为保持核酸药物的被动靶向能力和长效性提供了潜在的解决方法。

Cell Press：文中提及Mg2+在DNA折叠过程中起作用，那么Ca2+在所构建的体系中，除了作为纳米晶体的主要组成部分外，还起什么作用？

樊春海院士：Ca2+在这一体系中可以有效的替代Mg2+，起到中和DNA磷酸背骨架携带的负电荷的作用。我们在工作中详细研究了Mg2+，Ca2+的浓度差异对框架核酸结构完整性的影响。值得指出的是，钙缓冲溶液极易吸收空气中的二氧化碳，生成碳酸钙，因此在正常的DNA结构合成中，镁，钠缓冲液仍然是最优的选择。

Cell Press：文中框架核酸结构能够影响磷酸钙结晶和形貌，请樊院士谈一谈DNA或者生物大分子调控无机结构这方面的心得与展望。

樊春海院士：我们课题组在仿生矿化领域的研究是由刘小果博士开始的。天然生物矿物多在蛋白质框架，胶原纤维，氨基酸小分子的影响下生长，这离不开生物细胞的实时调控。因此，目前仿生矿化领域对典型生物矿物的结构控制仍然有限，很难模仿自然界中的精巧生物硬组织结构。而这些结构具备优异的物理性能，如力学，光学性质等。DNA结构纳米技术的优势是可人为写入框架的几何信息，这就绕过了DNA-RNA-Protein中心法则，直接使用框架核酸来替代蛋白框架，从而实现复杂有机-无机复合矿物的构建。进一步，通过对DNA的精确修饰，我们还可以构建各种生物矿化模型平台，甚至研究生物矿化中的单分子过程。

Cell Press：请樊院士分享自己做科研的一些感悟，并给年轻研究人员一些建议。

樊春海院士：多学科交叉合作是做原创性科研工作的重要保障。

论文通讯作者介绍

关于 樊春海 院士

樊春海，男，1974年3月出生，汉族，江苏省张家港市人。上海交通大学化学化工学院王宽诚讲席教授，中国科学院院士。1996年本科毕业于南京大学，2000年博士毕业于南京大学，2001-2003年在圣芭芭拉加州大学从事博士后研究。2004年入选中国科学院百人计划，2007年获得国家杰出青年基金资助，2012-2016年任科技部纳米973首席科学家。入选美国科学促进会(AAAS)、国际电化学学会(ISE)和英国皇家化学会(RSC)会士，兼任ACS Applied Materials & Interfaces副主编，ChemPlusChem编委会共同主席。自2014年起连续入选“全球高被引科学家”。部分成果获2016年国家自然科学二等奖(第一完成人)，并获2019年度何梁何利基金科学与技术创新奖、美国化学会“测量科学进展讲座奖”和第十二届“谈家桢生命科学创新奖”。

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Chem上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

论文标题：

DNA Framework-Encoded Mineralization of Calcium Phosphate

论文网址：

https://www.cell.com/chem/fulltext/S2451-9294(19)30550-9

DOI:

https://doi.org/10.1016/j.chempr.2019.12.003

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