NIPSS技术首次实现microRNA单分子直接测序丨CellPress对话科学家

近日，南京大学黄硕教授团队借助新近研发的纳米孔错位测序技术（Nanopore Induced Phase-shift Sequencing, NIPSS），首次实现了miRNA的直接单分子测序，miRNA的序列及修饰信息亦可在测序过程中同步获取。该工作以“Direct microRNA sequencing using Nanopore Induced Phase-shift Sequencing（NIPSS）”为题，发表在Cell Press旗下交叉学科期刊iScience上。

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MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为22个核苷酸（22nt）的非编码小分子RNA。“身板”小，“能量”可不容小觑，miRNA的短序列中蕴藏着丰富的功能信息，几乎涉及了生命过程的方方面面，如生长发育，新陈代谢，病毒感染，免疫反应，以及肿瘤的发生转移等等[1]。miRNA通过碱基互补配对作用靶向mRNA，调控基因表达进而实现这些功能。这一过程中，除了包含A,U,C,G四种经典碱基的序列组合，存在于miRNA上的碱基修饰也发挥着重要的作用。已有研究证明，存在于miRNA的m6A修饰可以影响miRNA的生物合成过程[2]，并且，其修饰水平的紊乱与胃肠癌密切相关[3]。因此，通过对单个miRNA分子直接测序来破译miRNA的序列及修饰信息，可以为理解生命过程及癌症的诊疗提供宝贵的信息。

由于miRNA自身长度极短，现有技术还不能在单分子水平上直接读取miRNA序列。常规的miRNA测序方法仍然需要逆转录后扩增的方法间接实现测序。然而，miRNA的修饰信息会在测序过程中因反转录和扩增而丢失，miRNA的直接测序仍是困扰研究者的一大难题，不利于通过测序精准定位miRNA上的核酸修饰信息，且从原理上无法对单个miRNA片段上的多种核酸修饰同时进行测序分析。

纳米孔测序技术作为新兴的单分子测序技术，无需扩增，可以根据碱基自身的理化性质来读取核酸序列，是最直接的核酸测序检测方法。然而，现有纳米孔测序技术更多关注于长读长的基因组或转录组的直接测序，对于极短的非编码RNA的直接测序还没有相关报道。在技术层面上，现有纳米孔测序平台亦不适用于分析诸如miRNA在内的极短非编码RNA。

“纳米孔错位测序技术（Nanopore Induced Phase-shift Sequencing, NIPSS）是近年来由南京大学黄硕团队原创开发的新型通用测序方法[4]。有别于现有纳米孔测序技术仅能测序基因组或转录组，NIPSS对任意可以通过孔道的单分子分析物均可实施直接测序。虽然现有NIPSS测序技术的读长仅有15个碱基（15nt），但该读长与天然成熟miRNA的全长（22nt）极为接近，具有实现测序检测的技术可行性，并在本工作中首次得到了技术验证。

在该工作中，DNA-miRNA嵌合链被用做纳米孔测序的模板链（图1）。嵌合链可以通过使用T4 RNA连接酶连接待测miRNA 3端和DNA 5端来构建。在NIPSS测序过程中，DNA聚合酶合成DNA时，产生驱动力拉动嵌合链整体向cis侧移动，由于“位差”的存在，其连接的miRNA碱基逐个通过纳米孔识别位点，miRNA序列从而被纳米孔直接读取。原理上，NIPSS技术的读长由聚合酶合成位点与纳米孔识别位点之间的“位差”决定，其长度等价于该工作中所使用的MspA纳米孔道的高度，亦对应于miRNA 3端的15个碱基。虽然该读长不足以完美覆盖miRNA的全长，基于对现有全部人类miRNA的生物信息学分析 (http://www.mirbase.org/)，该读长足以直接区分99.5%的人类miRNA，已具备直接的应用性。

图1. NIPSS测序链DNA-miRNA的酶连接构建原理及结果表征。其中胶图中标注为DNA-miRNA的明显条带为所构建的待测嵌合链

作为概念验证，研究团队选择对几种与肿瘤关系密切的miRNA进行测序，包括致癌性miR-21和其变体miR-21+U (miR-21 3端单尿嘧啶添加产物)，以及抑癌性let-7a。几种miRNA都给出了与各自序列相对应的特征测序信号。序列差异较大的miR-21与let-7a（图2），以及序列高度相似的miR-21与miR-21+U（图3），都实现了很好的区分。作为领域内的首个miRNA单分子测序方法，NIPSS技术展现了高的测序分辨率，这对其应用拓展，例如鉴定高序列相似度的miRNA家族成员或单碱基变异，具有直接的检测价值。

图2. NIPSS技术表征致癌性miR-21与抑癌性let-7a

图3. NIPSS技术表征miR-21与miR-21+U。单个碱基的末端延申在纳米孔测序结果中被明显的显示了出来

在进一步的研究中，研究团队探索了NIPSS技术表征miRNA上序列修饰的能力。M6A作为一种广受关注的RNA 表观遗传学修饰，常见于mRNA。最近的研究表明，m6A修饰也存在于miRNA，并且具有生物学功能。然而目前还没有方法能在miRNA序列中定位m6A。在该工作中，研究团队在miR-21序列中人工引入了单个m6A修饰碱基（图4）作为概念性验证，进而在NIPSS测序过程中观测到m6A产生的特异性测序信号。相比于经典碱基A，m6A表现出更高的信号特征，从而能在miRNA序列中准确定位。相较于传统的二代测序技术，NIPSS技术在单分子水平获取miRNA序列的同时，序列修饰信息得以保留而被纳米孔直接探测，是目前对miRNA修饰信息进行直接单分子测序检测的唯一方法。

图4. NIPSS技术用于m6A修饰检测

研究团队认为，通过纳米孔道的工程改造及其他纳米孔道的引入，有望实现miRNA的全长测序。此外，黄硕教授团队近年来致力于开发基于纳米孔成像技术的低成本，高通量检测装置[5]，有望与NIPSS测序技术相结合，实现高通量的miRNA单分子测序。

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者黄硕教授代表团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。

作者专访

Cell Press： “纳米孔错位测序技术（Nanopore Induced Phase-shift Sequencing, NIPSS）最主要的优点有哪些？

黄硕教授：纳米孔错位测序技术NIPSS是我们课题组自2017年开始尝试开发的，面向多种生物高分子的通用型纳米孔测序技术。该方法充分借助MspA纳米孔道自身的长度所产生的位错，实现对于任意分子的直接纳米孔测序。该方法无需应对每一种待测分子独立开发纳米孔测序马达，大大减少了技术开发的工作量。虽然该方法的读长受到MspA孔道长度的限制，但是加上本工作在内，我们已经陆续实现了非天然核酸XNA和非编码核酸miRNA的直接纳米孔测序。在后续的工作中我们还将陆续实现对多肽，多糖以及其它高分子的直接纳米孔测序。可以说，NIPSS测序方法是对现有纳米孔测序技术的拓展和补充。

Cell Press：通过miRNA直接测序获取序列及修饰信息将对未来癌症诊疗起到哪些积极影响?

黄硕教授：就癌症的诊断来说，目前主要依靠影像学检测方法，然而一些无明显症状，藏匿位置比较隐蔽，或者处于早期状态的体积微小的恶性肿瘤，难以通过这种方法检查出来，这导致很多患者错过了最佳的治疗时机。MiRNA现在被认为是许多癌症的生物标志物，对于肿瘤的发展状态高度敏感，即便在癌症的早期阶段，miRNA的异常表达谱也能给出一些肿瘤的状态信息，且miRNA在不同的癌症中有不同的表达模型。现在的技术很难分析miRNA这种序列高度相似，十分微小，又包含序列修饰的疾病标志物。通过直接测序的方法可以准确鉴定miRNA，对于未来实现癌症的精准诊断，从技术手段来讲是一个有力的补充。此外，由于miRNA可以充当原癌基因或者抑癌基因的角色，由此可以作为肿瘤治疗的靶点，近年来一些靶向miRNA的肿瘤治疗策略在临床上也取得了进展，miRNA的直接测序方法也有助于这些肿瘤靶点的鉴定与筛查，促进miRNA癌症疗法的发展。

Cell Press：研究过程中是否遇到困难?您和您的团队是如何攻克的?

黄硕教授：NIPSS错位测序方法从概念上极为容易理解。我们在该课题的完成中也总体较为顺利。然而，为了让该方法从概念真正走向实际，我们亟需在本文中展示一种高效的miRNA和DNA耦连方案，并进而实施NIPSS进行测序验证。在当时这给我们带来了一定的困难。论文第一作者张金月同学在实验中广泛借鉴了包括化学耦连和分子生物学耦连的多种策略，最终发现并验证了本文中所报道的酶耦连方法，并进而在纳米孔测序实验中得到了证实。可以说，一个关键实验的成功往往决定了一个工作的高度。作为指导老师，我非常感激张金月同学在面对关键科学问题时的这份坚持和努力。

Cell Press：您和您的团队接下来将根据这项工作进行哪方面的研究？

黄硕教授：纳米孔错位测序方法NIPSS的核心是对生物孔道MspA物理高度的充分利用。然而，仅仅能读取15个碱基还是不足以应对更广泛的待测物。以该工作为基础，我们后续研究思路包括进一步改造孔道，从而延申错位测序读长来拓展NIPSS测序技术的有效读长。同时，我们将进一步开发具有高度特异性的核酸-分析物耦连反应实现对更广泛待测物的NIPSS展示。

Cell Press：对于交叉学科研究，您有哪些心得体会可以与广大科研人员分享?

黄硕教授：我和我的团队所从事的科研工作覆盖了多个学科领域，包括化学，物理，生物以及工程科学。在面向具体研究对象科研探索中，使用单个学科的知识和技术积累往往难以完美解决所有问题。举例说明，本工作便融合了分子生物学中的酶耦连方法，分析化学中的测序概念和单分子生物物理学中的纳米孔技术。在我们的探索中，我们意识到只有通过不断学习新的知识并和同行合作、学习与请教，才能帮助我们不断有所创新。

本文参考文献（上线划动查看）

1. A. Mehta, D. Baltimore, Nat. Rev. Immunol. 2016, 16, 279-294.

2. C. R. Alarcon, H. Lee, H. Goodarzi, N. Halberg, S. F. Tavazoie, Nature 2015, 519, 482-485.

3. M. Konno, J. Koseki, A. Asai, A. Yamagata, T. Shimamura, D. Motooka, D. Okuzaki, K. Kawamoto, T. Mizushima, H. Eguchi, Nat. Commun. 2019, 10, 3888.

4. S. Yan, X. Li, P. Zhang, Y. Wang, H. Y. Chen, S. Huang, H. Yu, Chem. Sci. 2019, 10, 3110-3117.

5. Y. Wang, Y. Wang, X. Du, S. Yan, P. Zhang, H.-Y. Chen, S. Huang, Sci. Adv. 2019, 5, eaar3309.

论文通讯作者介绍

关于 黄硕 教授

黄硕，男，1984年6月出生于，江苏省南京市人。南京大学化学化工学院教授、博士生导师、国家青年千人计划入选者、江苏省双创人才入选者。2006年于南京大学物理系获得物理学学士学位；2011年于美国亚利桑那州立大学获得生物物理学博士学位；2011年至2014年在英国牛津大学从事博士后研究工作。2015年7月应聘南京大学化学化工学院教授并独立开展科学研究。现从事主要科研方向为基于单分子仿生纳米孔传感器的单分子荧光成像、单分子化学分析、单分子酶动力学与单分子纳米孔测序等应用。目前已于国际权威期刊Nature Nanotechnology, Nature Communications, Science Advances, Angewandte Chemie, Chemical Science, Nano Letters, Journal of Physical Chemistry C, Nanotechnology, Review of Scientific Instrument发表论文多篇。其中以第一作者发表Nature Nanotechnology 2篇，并入选2010年12月刊封面。已申请多项PCT国际专利，其中两项获得授权。

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊iScience上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

论文标题：

Direct microRNA sequencing using Nanopore Induced Phase-Shift Sequencing (NIPSS)

论文网址：

https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30100-0

DOI:

https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100916

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