邵峰/丁璟珒团队揭示细胞焦亡蛋白识别及激活机制丨CellPress对话科学家

2020年2月27日，北京生命科学研究所邵峰院士团队和中科院生物物理研究所王大成/丁璟珒研究组合作，在国际权威学术期刊Cell（《细胞》）在线发表题为“Structural Mechanism for GSDMD Targeting by Autoprocessed Caspases in Pyroptosis”的研究论文。该研究完整地揭示了天然免疫应答中caspase精确地自剪切活化，进而特异地识别和切割GSDMD，引发细胞焦亡的分子机制。

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图:天然免疫中caspase精确地自剪切活化，进而特异地识别和切割GSDMD，引发细胞焦亡的示意图

细胞焦亡是机体重要的天然免疫反应，在拮抗和清除病原菌感染中发挥关键作用，过度的细胞焦亡会诱发包括败血症在内的多种炎症性疾病。2015年邵峰团队的一项重要工作，是发现天然免疫中细胞焦亡是通过活化的半胱氨酸蛋白酶caspase-1和caspase-4/5/11切割共同的底物蛋白GSDMD而引发[1]。随后邵峰团队与王大成/丁璟珒研究组合作，进一步证明GSDMD是细胞焦亡的执行蛋白，活化的caspase切割GSDMD蛋白N端和C端结构域的连接区，释放具有结合膜磷脂上膜打孔活性的N端结构域，进而破坏细胞膜引发细胞焦亡[2]。然而，天然免疫中caspase在响应上游信号后如何活化，活化的caspase又是如何特异地识别和切割GSDMD的精确分子机制仍然不清楚，这也是细胞焦亡研究的关键科学问题。

Caspase-1和caspase-4/11属于保守的半胱氨酸蛋白酶caspase家族，该家族因在细胞凋亡通路中发挥关键作用而被广泛研究，caspase以非激活的酶原形式存在于细胞质中，在响应上游信号后通过分子内或分子间的剪切形成由大亚基p20和小亚基p10组成的异源二聚体而激活。研究人员进一步发现LPS激活的caspase-4同样会发生分子内自剪切，和caspase-11的特异性自剪切发生在p10亚基的N端所不同，caspase-4的自剪切会同时发生在p20亚基的C端以及p10亚基的N端两个位点。进一步突变实验发现，只有发生在p10亚基的N端保守的自剪切对于caspase-4的活化以及GSDMD的切割至关重要。

传统上对caspase蛋白酶的一个重要的认识，是其通过识别底物蛋白中具有xxxD（D为天冬氨酸，x为其它氨基酸）序列特征的四肽并在D后切割肽键实现对底物蛋白的活化，不同caspase对四肽序列的选择性偏好不同从而具有不同的底物识别谱。不同于细胞凋亡通路中的caspase会切割多种底物蛋白，GSDMD是caspase-4/5/11目前已知的唯一生理底物，caspase-1除了共享GSDMD作为底物以外，只能切割IL-1β/18两种细胞因子帮助其成熟和分泌。因此识别四肽的特征很难解释天然免疫中这些caspase狭窄的底物识别谱。研究人员随后意外地发现caspase-4/11特异地识别GSDMD蛋白的C端结构域而不是切割位点的四肽序列。在此基础上，研究人员成功地测定了自剪切激活形式的caspase-4/11与GSDMD的C端结构域复合物的晶体结构，三维结构清晰地揭示了caspase-4/11的p20/p10异源二聚体进一步通过二聚化形成四聚体，在四聚体的界面上形成一个分子间的β折叠，这个β折叠独立于caspase的半胱氨酸活性中心，伸展向四聚体的外部，像一把钥匙插入到GSDMD C端结构域的一个疏水口袋中，由于活化的caspase四聚体具有两个对称的分子间β折叠，因此caspase-4/11和GSDMD的C端结构域形成了一个2：2状态的酶-底物复合物。复合物的分子界面也很好地解释了p10 N端的延长会导致与GSDMD C端结构域的结构冲突，因此活化的caspase需要在p10 N端发生精确的自剪切才能获得GSDMD识别与切割的能力，这与功能研究的结果一致。基于结构设计的定点突变实验进一步证明三维结构揭示的保守作用方式就是活化的caspase-4/11特异地识别和切割GSDMD介导细胞焦亡的分子基础。随后研究人员进一步通过生化和细胞实验，以及caspase-1和GSDMD C端结构域复合物晶体结构的解析，证明了自剪切活化的caspase-1采用和caspase-4/11完全相同的方式，通过特异地识别GSDMD的C端结构域来实现对底物GSDMD的切割和活化。

这项系统的研究工作，在国际上首次揭示了天然免疫中caspase自剪切活化和特异地识别GSDMD介导细胞焦亡的完整分子机理，也是caspase从发现至今首次获得与生理底物复合物的三维结构，为caspase酶活机制和底物识别机制研究提供了全面深入的理解。具有重要生理功能的caspase一直都是重要的潜在药物靶标，但是由于caspase酶活中心具有很高的保守性，因此针对某一caspase开发的抑制剂很难具有高度特异的选择性。这项研究发现的独立于酶活中心的全新底物识别位点，为针对caspase和GSDMD开发自身炎症性疾病和败血症的药物提供了一个重要的新方向。

北京生命科学研究所邵峰院士和中科院生物物理研究所丁璟珒研究员为本文的共同通讯作者，该研究由中科院战略先导科技专项，国家自然科学基金基础医学中心项目和优青项目，科技部重点研发计划，中国医科院创新医学单元项目，以及中科院青促会项目支持。

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者之一丁璟珒研究员代表团队接受了专访，请他进一步为大家详细解读。

作者专访

Cell Press：本研究中开发的抗GSDMD的抗体是否有望成为更高效地检测细胞焦亡及治疗相关疾病的新手段？

丁璟珒研究员：GSDMD是细胞焦亡的直接执行者，GSDMD的切割是天然免疫中活化的caspase引起细胞焦亡的重要标志。自GSDMD发现以来，许多实验室和公司开发了能够识别GSDMD的抗体，但是这些抗体绝大多数都不能特异地识别被caspase切割活化的GSDMD片段，我们的研究就是针对caspase活化的GSDMD片段开发出特异性识别的抗体，这些抗体具有很高的灵敏性和很好的特异性，实验结果也显示抗体能广泛地应用于免疫印迹、免疫荧光标记和细胞的免疫染色等研究，特别是利用我们开发的抗体，在肝硬化或肝衰竭病人的病理肝组织样品的免疫组化实验中发现广泛存在GSDMD的切割活化，这提示细胞焦亡可能有着更广泛的生理和病理学意义。因此，这些抗体为今后在各种生理和病理条件下检测GSDMD介导的细胞焦亡提供了有力的工具。

Cell Press：本研究揭示了几种Caspase靶向GSDMD不同的工作机制，对于针对caspase的药物开发具有重要意义，那么您团队下一步是否会将研究重心放在药物研发方向上来呢？

丁璟珒研究员：Caspase蛋白酶从发现至今已经接近30年了，由于其在程序性细胞死亡中发挥关键作用，caspase一直都是抗肿瘤和免疫调节的重要潜在药物靶标。但是由于caspase酶活中心具有很高的保守性，因此针对某一种caspase开发的抑制剂很难具有高度特异的选择性。我们的研究发现了天然免疫中caspase独立于酶活中心的一个全新底物识别位点，这个位点对应于GSDMD上一个独立于caspase切割位点的全新结合口袋，这些发现为针对caspase和GSDMD开发自身炎症性疾病和败血症的药物提供了一个重要的新方向。因此下一步我们计划继续和邵老师的团队合作，针对这些重要的位点筛选和设计可行的抑制剂，为药物研发寻找到一些真正具有潜力的前导化合物。当然，围绕天然免疫细胞焦亡通路的基础研究也是我们工作的重要内容，我们已经先后在GSDMD执行细胞焦亡的分子机制、自剪切活化的caspase特异地识别和切割GSDMD的分子机制两个环节展开了系统的研究，逆流而上，下一步我们也会重点关注天然免疫中的caspase，特别是作为细菌脂多糖的胞内免疫受体的caspase-4/5/11，在通路上游是如何特异地识别LPS激活的，这也是细胞焦亡研究的另一个关键科学问题。

Cell Press：在本研究中您团队所遇到的最棘手的问题是什么？又是如何攻克的呢？

丁璟珒研究员：传统上对caspase蛋白酶的一个重要的认识，是其通过识别底物蛋白中具有xxxD（D为天冬氨酸，x为其它氨基酸）序列特征的四肽并在D后切割肽键实现对底物蛋白的活化，不同caspase对四肽序列的选择性偏好不同从而具有不同的底物识别谱。我们的研究意外地发现天然免疫中的caspase特异地识别GSDMD蛋白的C端结构域而不是切割位点的四肽序列，这和传统的认识截然不同，因此我们需要大量可靠的实验证据来证明我们的发现是正确的，这其中就包括直接测定自剪切活化的caspase和GSDMD复合物的三维结构来揭示caspase-GSDMD全新的识别机制。现在我们知道二者相互作用的界面并不广泛，作用的分子部位也具有一定的结构柔性，这导致在结晶的过程中，我们所获得的复合物晶体很难致密地堆积达到很好的衍射力从而帮助我们获得高质量的结构模型。我们采用了一系列优化的措施，包括广泛筛选用于结晶的蛋白质片段、接种生长蛋白质晶体，数据采集前对晶体进行交联固定，这些方法的综合结果帮助我们最终获得了可以用于结构解析的衍射数据。此外，为了证明我们发现的caspase-GSDMD全新的识别机制具有普遍的意义，我们把天然免疫中的caspase，包括广泛研究的caspase-1和caspase-4/11都开展了平行研究，三种蛋白与GSDMD都获得了复合物的三维结构模型，并通过定点突变和生化、细胞实验开展验证，所以我们准备了大量的实验数据来证明我们的发现，两位开展研究工作的共同一作做了很大的努力，谢谢他们。

Cell Press：作为中科院青年创新促进会成员，您有哪些心得体会可以与处于科研事业刚刚起步的青年学者分享？

丁璟珒研究员：很荣幸能够成为中科院青促会的一员，和青促会的大多数同仁一样，我也是没有海外经历土生土长、并且留在培养单位开始自己科研生涯的青年研究人员，非常感谢中科院的青促会项目，它给像我一样的青年人提供了开始自己独立的科研工作第一份支持和一个亲切的舞台。谈不上什么心得，我想我的同仁们和我一样，都能理解科学研究作为一项特别的工作，需要你发自内心的浓厚兴趣，对科学的执着坚持，科研过程中的独立思考和判断，开展实验的严谨和细致，对实验结果的客观总结和逻辑思考，以及研究团队的通力合作。围绕这些品质，我许多青年学者一样，都还在努力的路上。

论文通讯作者简介

关于 邵峰 院士

现任北京生命科学研究所科研副所长、资深研究员，中国科学院院士。1996年毕业于北京大学技术物理系，1999年于中科院生物物理所获得硕士学位，2003年美国密西根大学生物化学系获得博士学位。

长期研究病原细菌和宿主相互作用机理，在致病菌毒力机制以及抗细菌天然免疫方向均取得系列重要原创性发现：包括发现细菌内毒素（LPS）、鞭毛以及病原菌三型分泌系统的胞内天然免疫受体（组装形成炎症小体复合物），进而揭示和阐明了这些受体下游的炎性caspase通过剪切活化Gasdermin D（GSDMD）蛋白诱导细胞焦亡的确切分子机制；这些发现为败血症药物和细菌疫苗的研发提供了新的理论基础，其中有关Gasdermin家族蛋白的鉴定和机制的阐述也将细胞焦亡的概念重新定义为由Gasdermin家族介导的细胞程序性坏死。邵峰博士已发表学术论文70多篇，总引用9,000多次，2005年回国后以通讯作者在《自然》、《科学》和《细胞》三大杂志发表研究论文13篇；获得多项国际和国内重要奖项，包括周光召杰出青年基础科学奖、HHMI国际青年科学家奖、国际蛋白质学会鄂文西格青年科学家奖、吴阶平-保罗杨森基础医学奖以及何梁何利基金科学与技术奖等，入选北京市海外高层次人才工程、国家百千万人才工程、首届“北京学者”以及国家万人计划（领军人才），为享受国务院特殊津贴专家，2015年当选为中科院院士和EMBO的外籍成员，2016年当选为美国微生物学院院士（fellow）。

关于 丁璟珒 研究员

中国科学院青年创新促进会会员，国家“优秀青年基金”获得者，中国科学院生物物理研究所，生物大分子国家重点实验室，研究组长。

研究方向：丁璟珒课题组围绕天然免疫防御和病原菌感染与耐药这一主题开展了系统的研究工作，取得了重要的研究成果，包括破解宿主天然免疫应答中细胞焦亡的关键分子机制(Nature 2016)，揭示病原菌通过新颖的精氨酸糖基化修饰阻断宿主死亡受体信号通路的完整分子机理(Mol Cell 2019)，揭示超级细菌金属β内酰胺酶NDM-1水解头孢类抗生素的催化机制(JACS 2014)。现阶段课题组将继续聚焦病原菌与宿主天然免疫通路的直接对话，深入研究病原菌效应蛋白拮抗宿主天然免疫防御通路的精确分子机制，揭示新型天然免疫受体识别病原相关分子模式激活免疫应答的工作原理，为抗菌感染、免疫调节和抗炎治疗药物的研发提供坚实的理论基础。

本文参考文献

1. Shi J.Zhao Y.Wang Y.Gao W.Ding J.Li P.Hu L.Shao F.

Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.

Nature. 2014; 514: 187-192

2. Ding J.Wang K.Liu W.She Y.Sun Q.Shi J.Sun H.Wang D.C.Shao F.

Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family.

Nature. 2016; 535: 111-116

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

论文标题：

Structural Mechanism for GSDMD Targeting by Autoprocessed Caspases in Pyroptosis

论文网址：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30146-X

DOI:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.002

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