“脆弱的基因”：重新定义结核杆菌中的关键基因 | Cell Press青促会述评

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作为世界领先的全科学领域学术出版社，细胞出版社特与“中国科学院青年创新促进会”合作开设“青促会述评”专栏，以期增进学术互动，促进国际交流。

2021年第二十六期（总第63期）专栏文章，由中国科学院微生物所研究员 王军，就Cell中的论文发表述评。

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快速增长的细菌耐药性是临床感染治疗中面临的重大威胁，已经被世界卫生组织定为本世纪迫切需要解决的人类安全问题之一。结核分枝杆菌作为一类与人类共同生存历史超过8000年的致病菌，在现有成熟的治疗手段情况下每年仍然造成全球重大生命损失，尤其是在中低收入国家广泛传播造成大量的临床感染和死亡。在细菌耐药性不断增加的背景下，针对结核杆菌以及其他细菌的新药创制需要新的思路。现有的药物靶点主要关注细菌必需基因，但实现这些基因的完全抑制是小分子很难达到的；而被忽略的另一类非常有潜力的靶点，是在被不完全抑制的情况仍然能够有效的降低细菌活力的基因。

针对上述问题，近日来自于洛克菲勒大学Rock教授等人，通过CRISPRi技术扫描了结核杆菌中的基因位点并且定义了一个新的细菌基因重要性的衡量方法：基因的脆弱性（vulnerability)，即如果实现这个基因的不完全抑制，仍然可以造成明显的细菌的活力（fitness，增长速率和竞争能力）的减弱。这一类的基因的潜力在于未来即使对应的小分子药物不能实现完全的基因表达抑制，细菌本身的活力和毒性也有望明显降低，从而扩大药物筛选的靶点范围，有利于新药的开发。该文章于7月22日发表于Cell Press的旗舰期刊Cell上。

图1是该研究的主要的方法，作者们通过在结核分枝杆菌以及其他细菌中利用CRISPR技术基础上的基因干扰（CRISPRi）文库，转入细胞后通过调控sgRNA的表达以及细菌的竞争生长试验，在不同的传代时间利用大规模测序检测不同序列的丰度。其中，作者们最感兴趣的是在基因表达受到抑制程度相同的情况下，细菌本身活力受影响相对较大的一系列的基因。作者建立了基于贝叶森基础上的估算模型，能够对于基因的脆弱性进行估计，并且以此为基础，对结核分枝杆菌基因组上不同基因位点的脆弱性进行了判定，进一步通过试验方法验证了该方法的准确性。

▲图1  本研究主要的技术路线。通过建立包括9万多个sgRNA的CRISPRi文库，可以实现大规模，可控的基因敲除。在诱导sgRNA表达和不诱导的情况下分别进行传代和竞争性的生长试验，通过大规模测序确定不同突变体（sgRNA）的丰度。最终计算不同基因在受到一定程度抑制情况下，细菌本身的生长抑制（即基因的脆弱性）。

作者们进一步针对其中脆弱性较为明显的基因，作者还进行了更深入的进一步验证，用独立的试验表明了这些基因在被不完全的抑制的情况之下，的确可以明显的减少细菌本身的生长速率。作者进一步在其他结核菌的菌种，以及其他细菌属中进行了保守性的验证，发现这些脆弱性比较高的基因在物种上是相对保守的，在功能通路上也集中于细菌的转录和翻译等关键的中心法则相关的通路。最后，作者们还发现在一个高毒力的结核分枝杆菌之中，因为一系列的基因突变，本文前期所发现的脆弱基因在受到抑制的情况下，对于细菌本身的影响相对于低毒力的毒株更小，由此可以部分解释该物种的表型的差异，也对未来的药物研发和治疗有一定的启示。

▲图2 本文中鉴定的一系列脆弱性较高基因所属的代谢通路（D）和生理生化过程（E）。

综上所述，本文中作者们利用CRISPRi作为高通量的筛选手段，在一个重要的人类病原中定义并且确定了大量基因的脆弱性。这些脆弱性高的基因具有进化上的保守性，能够在不完全抑制的情况下就对细菌本身的生长造成明显的影响，因此适合作为未来开发新的小分子抗菌药物的靶点。脆弱性高的位点多参与细菌的转录和翻译过程，并且在临床菌株间基因脆弱性的不同也有助于解释和应对耐药性和毒力等的差异。

论文摘要

抗菌物质通常靶向细菌的必需基因但是很少能实现完全抑制；因此，这种“全或无”的基因必要性定义忽略了另一类非常有潜力的基因，即“脆弱”或者是在受到不完全抑制情况下即能显著影响细菌生长的基因靶标。基因的脆弱性是连续可量化的指标，与细菌的活力显著关联。本研究中我们建立了一个CRISPR干扰系统上的高通量筛选方法并且系统研究了结核分枝杆菌中基因的脆弱性，并且发现了多个脆弱的基因靶点可以供新药开发使用；同时还发现了非脆弱性的必需基因，一定程度上解释药物开发所面临的问题。进一步研究还发现高毒力株的脆弱性降低，与对药物耐受性提高很有可能相关。本研究结果量化了细菌关键的生命过程并且提供了具有重要价值的药物研发靶标。

Antibacterial agents target the products of essential genes but rarely achieve complete target inhibition. Thus, the all-or-none definition of essentiality afforded by traditional genetic approaches fails to discern the most attractive bacterial targets: those whose incomplete inhibition results in major fitness costs. In contrast, gene ‘‘vulnerability’’ is a continuous, quantifiable trait that relates the magnitude of gene inhibition to the effect on bacterial fitness. We developed a CRISPR interference-based functional genomics method to systematically titrate gene expression in Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and monitor fitness outcomes. We identified highly vulnerable genes in various processes, including novel targets unexplored for drug dis- covery. Equally important, we identified invulnerable essential genes, potentially explaining failed drug dis- covery efforts. Comparison of vulnerability between the reference and a hypervirulent Mtb isolate revealed incomplete conservation of vulnerability and that differential vulnerability can predict differential antibacterial susceptibility. Our results quantitatively redefine essential bacterial processes and identify high-value targets for drug development. 

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述评人简介

王军

中国科学院微生物所研究员

[e-mail]

王军，中国科学院微生物所研究员，德国马普学会合作研究组负责人。入选海外高层次人才项目（2017），北京市“科技新星”（2020）等人才项目，承担国家自然科学基金重大研究计划培育项目，新冠应急攻关项目，科技部重点研发项目课题等。主要从事微生物组为核心的生物信息学和计算生物学研究，近年在疾病相关的微生物组研究，以及新技术应用等发表一系列文章，以第一和/或通讯作者在Science, Nature Genetics (2篇), Cell Host Microbe, PNAS, Nature Communications,Protein Cell (2篇)，Microbiome（2篇）等重要期刊发表系列研究论文。

Dr. Jun Wang is a Principal investigator in CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, and also group leader of the Max-Planck Partner Group for Bioinformatics and Computational Biology. He was awarded as “1000 Talent Junior Program”  in 2017 and “Emerging Star of Science and Technology” of Beijing in 2020. Dr. Jun Wang’s laboratory is mainly interested in studying the bioinformatic tools and computational methods for health and disease-related microbiome. As the first or corresponding author, Dr. Jun Wang has published a series of research papers in journals including Science, Nature Genetics (2), Cell Host Microbe, PNAS, Nature Communications, Protein Cell (2)，Microbiome（2）.

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相关论文信息

原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell上，

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