“道法自然”：组合路径平衡构建恶臭假单胞工程菌高效生产2-氟-顺,顺-粘康酸 | Cell Press青促会述评

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作为世界领先的全科学领域学术出版社，细胞出版社特与“中国科学院青年创新促进会”合作开设“青促会述评”专栏，以期增进学术互动，促进国际交流。

2021年第三十六期（总第73期）专栏文章，由来自中国科学院微生物研究所 副研究员 中国科学院青年创新促进会会员 郭正彦，就 Chem Catalysis中的论文发表述评。

顺,顺-粘康酸酯[(2Z,4Z)-2,4-己二烯二酸；ccMA]是一种具有共轭双键和反应性二羧酸基团的工业增值产品，其特有的官能团使ccMA 特别适用于合成树脂和可生物降解聚合物。由ccMA 已经合成了许多重要化工原料，例如己二酸、己内酰胺、对苯二甲酸等，以及以它们为原料聚合合成工业品尼龙66，聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。过去几十年来，人们主要通过一下两种方法致力于用生物技术替代品取代油基工艺来生产ccMA：(i) 通过莽草酸途径以糖或甘油为原料从头生产芳香族前体，然后进行转化到邻苯二酚和环裂解成 ccMA；(ii) 芳香族原料的直接生物转化。尽管上述方法可用，但该分子的结构改造只能后期修改进行扩展。卤素原子引入ccMA分子及其衍生物中，可以使生物基ccMA生产的价值成倍增加，从而获得难以通过化学方法合成的产品。用氟代替氢原子已成为有机化学中的一项基本操作，即使单个氟原子的存在也能显着增强药物和单体的化学性质。更为重要地是，氟化对ccMA 衍生产品的影响以及聚合物应用有特别重要的意义。将氟引入聚合物结构会带来一系列工业相关优良特性，如：对酸、碱、溶剂和油呈惰性、低介电常数、低折射率、高抗老化和氧化性以及低表面张力等。但是，由于通过化学合成很难将氟特异性地引入复杂ccMA的分子结构中，且存在立体化学选择性等问题，因此，迫切需要合成氟化生物砌块用于生产此类生物基原料，其应用前景非常广阔。

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针对上述问题，近日来自丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心的Prof. Pablo I. Nikel等人报道了一种基于生物的策略，通过使用工程化假单胞菌细胞进行生物转化来生产氟化顺, 顺-粘康酸盐。作者基于克氏假单胞菌降解氯苯甲酸酯的天然途径，改造了恶臭假单胞菌的催化潜力，初步建立了一条将氟化苯甲酸盐转化为相应的卤化粘康酸盐的途径。然后通过合成生物学的设计-构建-测试-学习循环优化了关键的生物催化元件，采用组合途径平衡方法最终使 3-氟苯甲酸酯 (3-FBz) 完全转化为2-氟-顺,顺-粘康酸酯。这种“受自然启发”的合成生物学改造进一步扩大细菌细胞工厂的催化能力，促成了无法获得的化合物的生物合成。该文章于9月23日发表在Cell Press旗下旗舰刊Chem Catalysis上。

▲图1  (氟化)苯甲酸酯在野生型假单胞菌中的降解 (A)作用于苯甲酸酯及其氟代衍生物 2-FBz、3-FBz 和 4-FBz 的生化活性。其中，BenR 和 CatR 在恶臭假单胞菌中的正转录调控用“+”符号表示。参与将 3-FBz 转化为 2-FMA 的酶用其相应的 EC 编号标注。(B) 编码邻位裂解途径的基因的染色体结构图。注：BenABC，苯甲酸 1,2-双加氧酶；BenD, 1,2-二氢二羟基苯甲酸脱氢酶；CatA，儿茶酚 1,2-双加氧酶；CatB，粘康酸环异构酶；CatC，粘糖酸内酯-异构酶；BenR，转录调节因子；CatR，LysR 家族转录调节因子；1,2-DHB, 1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；2-F-1,2-DHB，2-氟-1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；3-F-1,2-DHB，3-氟-1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；4-F-1,2-DHB，4-氟-1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；5-F-DHB，5-氟-1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；6-F-DHB，6-氟-1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；2-FMA、2-氟-顺,顺-粘康酸盐；3-FMA，3-氟-顺,顺式-粘康酸盐。

图1展示了野生型假单胞菌中的降解（氟化）苯甲酸酯的途径，苯甲酸酯通过苯甲酸 1,2-双加氧酶BenABC转化为1,2-二氢二羟基苯甲酸酯；再由1,2-二氢二羟基苯甲酸脱氢酶转化为邻苯二酚，再由儿茶酚1,2-双加氧酶发生邻位裂解生成顺,顺-粘康酸盐。同样，氟化苯甲酸酯也采用这条代谢途径。芳环上的氟取代位置决定了相应的化合物是否完全降解。其中底物为4-FBz 时， 产生中间体 4-氟-邻苯二酚(4-FC) 和 3-氟-顺,顺-粘康酸盐 (3-FMA)可以进一步脱氟成三羧酸 (TCA) 循环中间体。通过生物信息学、生长实验、发酵中间产物监测等实验对比分析克氏假单胞菌和恶臭假单胞菌中降解氟化苯甲酸酯优劣势，得到如下结果：(i) 3-FBz 是 2-FMA 最合适的前体， (ii) 恶臭假单胞菌生物转化氟化苯甲酸酯为 2-FMA具有更快的速率和更高的抵抗力。

▲图2 第一代生物转化3-FBz的恶臭假单胞工程菌(PMP)的特征和性能。(A) 工程化的产生 2-FMA 的恶臭假单胞 (PMP) 菌株，其命名沿用菌株 KT2440 中编码相关酶活性的基因簇；(B) 第一代工程菌株在摇瓶发酵中的生物转化性能。将菌株在用 DBM 培养基填充至 10% (v/v) 的三角锥形瓶中培养，该培养基含有 30 mM的葡萄糖和10 mM的3-FBz；24小时后测量细胞外代谢物的浓度。通过Student's t-检验比较与野生型恶臭假单胞菌的2-FMA 浓度（两个样本，未配对）。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

图2展示第一代生物转化3-FBz的恶臭假单胞工程菌的特征和性能。第一轮菌株工程中采用了系统地组成型和诱导型表达驱动关键基因。在高浓度的3-FBz条件下，BenR/P_ben提供了与P_tac相当的表达水平；与野生型菌株KT2440相比，在菌株PMP1000中观察到的消耗略有增加（图 2B）。相比之下，控制catA转录的CatR/P_cat是响应3-FBz 的最强系统。任何增加儿茶酚1,2-双加氧酶基因表达的努力都会导致3-FC的有害积累，相应的催化活性降低。

图3展示了第二代生物转化3-FBz的恶臭假单胞工程菌的性能。通过用 P_m(BCD10)（在菌株 PMP0020/pSEVA228和PMP0001/pSEVA228中）单独替换天然catA和catA-II调控序列导致3-FC形成增加，但两种操作结合（菌株 PMP0021/pSEVA228）与恶臭假单胞菌KT2440相比降低了3-FC形成水平，却使2-FMA生物合成提高了2倍。然后，通过在菌株PMP1021/pSEVA228中额外实施P_tac→benABC来纠正这种情况，这增强了3-FBz的吸收并导致完全的转化，没有3-FC积累，即最大理论产量。2-FMA是在PMP1021/pSEVA228 菌株培养物中检测到的唯一含氟代谢物（图 3B）。

▲图3  第二代生物转化3-FBz的恶臭假单胞工程菌(PMP)的性能。在用 DBM 培养基填充至 10% (v/v) 并补充有 30 mM的葡萄糖和 10 mM的 3-FBz 的锥形瓶中培养菌株。(A) 培养 24 小时后细胞外氟代代谢物的模式。通过Student's t-检验比较与野生型恶臭假单胞菌KT2440的2-FMA 浓度（两个样本，未配对）。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。ns，不显着。(B) PMP1021/pSEVA228 菌株的 24 小时培养基、从上清液中纯化的 2-FMA 和化学合成的 2-FMA 标准品的 HPLC 色谱图（UV 检测波长为 280 nm）。

分析第二代工程菌发现仅当从质粒pSEVA228 提供 XylS 时才能观察到第二代 PMP 菌株的催化性能增强，正如菌株PMP1041积累的3-FC所揭示的那样。因此，需要进一步解析哪个catA具有最大的影响关于生物转化。通过 Pm(BCD2)（菌株PMP1030/pSEVA228）表达catA导致3-FC积累，但调整catA-II（菌株PMP1002/pSEVA228）的表达使3-FBz化学计量转化为2-FMA。表明CatA-II是主要负责将3-FC转化为2-FMA的双加氧酶。为了增强 3-FBz 的吸收，三个苯甲酸盐转运相关基因（即 benK、benE-II 或 nicP-I）中的每一个都被置于 PMP1021/pSEVA228 菌株背景中的 Pm(BCD10) 控制之下。虽然这些菌株中的每一个都保持平衡转化，但生物量的转化效率显着降低。

▲图4 第三代生物转3-FBz的恶臭假单胞工程菌(PMP)的性能。实验在用DBM培养基填充至10% (v/v)的锥形瓶中进行，该培养基补充有30 mM的葡萄糖和10 mM的3-FBz。 Glcnt，葡萄糖酸盐；2-KG, 2-葡萄糖酸；CDW，细胞干重。

为了在不使用质粒的情况下实现3-FBz生物转化和表征P_tac(BCD10)→benABC 和Δcrc 的作用，利用在catA-II 或两种 catA基因都放置组成型 P_14b 启动子和BCD10 元件构建了第三代 PMP 菌株PMP1053、PMP1053d、PMP2053和 PMP1023/pSEVA228(.2)中，其发酵曲线如图4所示。PMP1053 菌株中 P_tac→benABC、P_14b(BCD10)→catA 和 P_14b(BCD10)→catA-II 的组合启用完全在没有质粒的情况下，3-FBz (q_S = 1.24 ± 0.01 mmol∙gCDW^-1∙h^-1) 在最大理论产量和最高比生产率 (q_P = 0.63 ± 0.04 mmol∙gCDW^-1∙h^-1) 下完成转化。另外，通过构建另一系列工程菌株中测试了xylS 调节基因作用，证实无需质粒，xylS调控catA-II的表达足以实现完整的 3-FBz，即通过控制catA-II表达可以有效解决3-FC 解毒问题。因此，组合途径平衡解决了围绕这种含氟代谢物的代谢瓶颈。

基于以上结果，第三代工程菌PMP1053 被保留作为 2-FMA 生物合成的最佳生物催化剂。通过测试了菌株 PMP1053使用苯甲酸盐作为唯一碳源的能力，以及在 30 mM 葡萄糖作为主要底物存在时耐受的最大3-FBz浓度（图 5A）。菌株 PMP1053 在高达 50 mM 3-FBz的浓度下，尽管降低的最大增长速度和最大生物量浓度，但是仍能继续生长。重要的是，与野生菌株KT2440相比，第三代工程菌 PMP1053 的培养物中没有观察到培养基着色，表明消耗的3-FBz被同化，无聚合物形成。在DBM培养基中2-FMA的毒性研究表明，当暴露于2-FMA 时，菌株PMP1053的生长曲线几乎与野生型菌株相同。

综上所述，在所有工程化恶臭假单胞菌变体中，菌株 PMP1053 不仅在动力学参数方面具有最佳性能，但它也对有毒的含氟代谢物（尤其是生物转化底物）具有优异的耐受性。这些特性使这种完全工程化的菌株适合利用其丰富的代谢能力和压力耐受性来探索新工业氟化构建生物砌块的生物合成。

▲图5 野生型和工程恶臭假单胞菌的生物转化底物和产物的毒性。恶臭假单胞菌 KT2440 和工程菌株PMP1053在微量滴定板中培养，含有200 µL的DBM培养基和所示的各种添加剂。(A) 菌株KT2440和PMP1053 在30 mM 苯甲酸盐 (Bz) 或30 mM的葡萄糖上在增加3-FBz 浓度的情况下的生长模式和动力学参数。(B) 具有30 mM的葡萄糖和增加 2-FMA 浓度的菌株 KT2440 的生长模式和动力学参数。

论文摘要

工业微生物通过生物基“砌块”生产的工业化学品很少含有卤素原子。粘康酸是一种合成多种工业产品的化工原料，其可以通过引入氟原子调整其物理化学性质来扩大应用范围。土壤细菌恶臭假单胞菌可以通过以顺式、顺式粘康酸为中间体的邻位裂解途径来同化苯甲酸。在这里，利用天然酶促机制（编码基因簇为ben和cat）从氟化苯甲酸盐中催化获得 2-氟-顺,顺-粘康酸盐 (2-FMA)。该途径中的反应高度不平衡，导致有毒中间体的积累和底物转化受限。通过解开ben 和cat响应氟化效应物的调节模式，调整代谢流导向2-FMA生物合成。实施这种组合方法后，工程恶臭假单胞菌以最大理论产率将3-氟苯甲酸酯转化为2-FMA。因此，这项研究证明了合成生物学如何扩展自然界生化催化的多样性。

The wealth of bio-based building blocks produced by engineered microorganism seldom include halogen atoms. Muconate is a platform chemical with a number of industrial applications that could be broadened by introducing fluorine atoms to tune its physicochemical properties. The soil bacterium Pseudomonas putida naturally assimilates benzoate via the ortho-cleavage pathway with cis,cis-muconate as intermediate. Here, we harnessed the native enzymatic machinery (encoded within the ben and cat gene clusters) to provide catalytic access to 2-fluoro-cis,cis-muconate (2-FMA) from fluorinated benzoates. The reactions in this pathway are highly imbalanced, leading to accumulation of toxic intermedi-ates and limited substrate conversion. By disentangling regulatory patterns of ben and cat in response to fluorinated effectors, metabolic activities were ad-justed to favor 2-FMA biosynthesis. After implementing this combinatorial ap-proach, engineered P. putida converted 3-fluorobenzoate to 2-FMA at the max-imum theoretical yield. Hence, this study illustrates how synthetic biology can expand the diversity of nature's biochemical catalysis.

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评述人简介

郭正彦

中国科学院微生物研究所 副研究员

中国科学院青促会会员

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郭正彦，中国科学院微生物研究所副研究员，中国科学院青促会会员，主要从事微生物代谢产物的生物合成及合成生物学研究。至今在Angew. Chem. Int Ed., J. Am. Chem. Soc.、PNAS、Nat. Prod. Rep.等SCI期刊上发表论文30余篇。2017年加入中国科学院青年创新促进会。

Zhengyan Guo is an associate professor in State Key Laboratory of Microbial Resources at Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences (IMCAS). His research interest mainly focuses on biosynthetic and synthetic biology for microbial chemical entities and drugs. Until now, he has published more than 20 papers in Angew. Chem. Int Ed., J. Am. Chem. Soc.、PNAS、Nat. Prod. Rep., etc. He was selected as a member of Youth Innovation Promotion Association of CAS (2017).

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原文刊载于CellPress细胞出版社

旗下期刊Chem Catalysis上，

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