erenumab (AMG 334) 的作用机制研究
2016年，Amgen 公司的Cen Xu 团队首次在Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 上发表关于AMG 334抗体（请参阅：靶向CGRP及CGRP受体的偏头痛治疗方案｜第一款靶向GPCR的抗体药：Aimovig® (erenumab)）的研究细节。
AMG 334抗体的产生方法
使用纯化的可溶性CGRP受体蛋白作为抗原对XenoMouse®进行免疫，其中可溶性CGRP受体蛋白，由人源CRLR受体的N端细胞外结构域（ECDs）（GenBank ID: AAA62158，氨基酸1-138）和人源RAMP1的N端胞外结构域（GenBank ID: CAA62158，氨基酸1-117）通过瞬时共转染HEK293 6E细胞进行表达。
使用标准杂交瘤制备方案，从具有最高血清滴度的小鼠中产生。通过一系列筛选实验，鉴定得到AMG 334抗体，包括结合竞争、功能阻断和受体选择性等实验。（部分抗体筛选和鉴定实验已公开专利(AU 2009330175 B2)资料）
AMG 334抗体的活性鉴定
AMG 334对同位素标记多肽 [125I]-CGRP与人类神经母细胞瘤细胞膜结合的剂量依赖性抑制作用。
AMG 334 能有效地拮抗CGRP受体(右)，却没有CGRP的内源性的激动剂活性（左），暗示AMG 334 是CGRP受体的拮抗剂。
AMG 334 能够选择性地拮抗人、猴的CGRP受体活性，而对鼠、兔、狗的CGRP受体功能不具有拮抗活性，这暗示AMG 334 结合在CGRP受体的序列不保守的抗原表位。
通过建立CGRP 受体的激活模型，测量辣椒素诱导的皮肤血管扩张的时间过程，评估AMG 334对CGRP 受体的拮抗活性。下图A为通过多光谱激光成像仪测量辣椒素诱导的皮肤血管扩张的时间过程，下图B评价了AMG 334对降钙素基因相关肽受体的拮抗活性。
AMG 334抗体的分子识别机制
2020年，Cen Xu 团队在Cell Reports杂志发表关于AMG 334抗体识别CGRP受体的结构生物学机制。
作者报道了erenumab单抗与CGRP受体复合物的晶体结构，显示了一个直接的配体阻断机制。erenumab单抗的重链和轻链多个CDR区域参与识别作用，除了直接与CGRP受体的胞外结构域相结合，还与RAMP1 相互作用。
通过BLI 亲和力测定和细胞水平的cAMP 活性测试，作者对erenumab单抗CDR区域的多个突变体进行活性评估，对晶体学观察进行了实验验证。
抗体筛选和鉴定研究中，作者发现抗体的亲和力和CDR3区域的长度，呈一定的正相关关系。
结构研究显示，较长的CDR3使得抗体能够与CGRP受体表面有更大的接触表面。这与抗HIV-1 单抗 (CDR-H3环可以长达25个残基) 的识别机制类似。长的CDR-H3结构在亲和力成熟过程中受到青睐，以使这些mAbs能够与HIV-1病毒的包膜糖蛋白中发现的凹陷表层相接触。
通过对比已报道的CGRP 多肽和CGRP受体的作用模式，作者认为erenumab单抗与CGRP识别相似的抗原表位，这使得erenumab能够竞争性拮抗CGRP的结合。另外，由于erenumab单抗识别了更大的受体表面区域，这使得其亲和力和选择性都较好。
开发靶向CGRP 受体的抗体分子的挑战
GPCRs占FDA批准的处方药目标的35%左右，尽管这一靶标类别有重大的治疗机会，但在批准erenumab之前，这些药物中没有一个是抗体治疗药物。这种抗体治疗药物的稀缺性是由于生成GPCRs功能性抗体的技术挑战造成的。
抗原稳定性和结构多样性：一般来说，抗体发现活动的成功率随着可溶性抗原形式的出现而增加，而保持可溶性抗原的结构和功能的准确性至关重要。这在GPCRs的情况下是困难的，因为它们含有多个跨膜结构域，导致它们的结构稳定性依赖于细胞膜的脂质层。GPCR的全长跨膜蛋白也可用于发现抗体，但由于其固有的免疫原性和抗原性特征较差，历史上这些抗体的成功率较低。
抗体的选择性：对于CGRP受体来说，还有更多的挑战，因为该受体是降钙素受体样受体（CLR）和受体活性修饰蛋白1（RAMP1）的异构复合物。CGRP受体与降钙素受体家族的肾上腺髓质素（AM）和淀粉酶（AMY）受体密切相关。CGRP受体的两个组成部分CLR和RAMP1也分别存在于AM1（CLR+RAMP2）、AM2（CLR+RAMP3）和AMY1（CTR+RAMP1）受体中。这些受体表现出对CGRP的敏感性。然而，AM1和AMY1都没有与偏头痛的病理生理有关。相反，循环中的淀粉酶水平在进食后会升高，该肽能有效地抑制胃排空和胃酸分泌，而肾上腺髓质素已被证明具有显著的作用范围，从调节细胞生长和分化，通过调节激素分泌，到抗菌作用。然而，这些相关的受体之间序列相似性带来了额外的挑战，在这种情况下，拮抗剂抗体单独与其中一个组份的不对称结合会导致抗体缺乏受体选择性。
参考文献