新年科研热点解读：单细胞测序助力类器官研究|单细胞专题
类器官与单细胞测序技术的重要性
近年来随着人类对生命科学认知的发展，人们已经掌握了许多生命活动的运行机制。但是随着研究的深入，有不少的研究领域遇到了科研瓶颈。以干细胞的研究为例，1867年德国实验病理学家Cohnheim在研究伤口炎症时发现了干细胞，并首次提出骨髓干细胞概念；直到一个世纪后的1963年，加拿大科学家McCulloch和Till首次证明血液中存在干细胞，正式开启干细胞研究领域的大门；1996年轰动世界的克隆羊Polly诞生，引发干细胞的研究热潮，此后许许多多的科研人员推动了干细胞领域的研究进展。值得一提的是，大部分科学家研究从干细胞到体细胞的分化方向，2006年日本科学家山中伸弥反其道行之，研究体细胞到干细胞的重编程过程并推出诱导性多能干细胞（iPSCs）技术，以此获得2012年诺贝尔医学奖，至此类器官领域在干细胞技术的发展中应运而生。
顾名思义，类器官（organoid）即类似于真实器官，是由不同类型的干细胞或者从病人身上提取的肿瘤组织在特定的3D体外微环境下自组织发育而来的，高度模拟体内真实器官特征的“体外微器官模型”。因其与体内组织器官具有相似的生理结构，能够表现出细胞与细胞之间，细胞与周围基质之间的相互作用，因此在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛的应用前景。但是怎样判断体外培养的类器官与体内真实器官的相似程度，怎样分析类器官分化发育功能进而映射体内发育，怎样利用肿瘤类器官揭示肿瘤的异质性和耐药性等特征是一个棘手的问题。
类器官培养系统
类器官结合单细胞测序成为研究热点
纵观类器官生物技术研究的发展趋势，主要是从中低纬度分析到高维度分析的过程。中低纬度技术是以成像技术和样本全分析（DNA测序、RNA测序、ATAC测序、ChIP测序等）为主的分析，其中成像技术是最简单、最广泛使用的技术，可以以直接观察的方式分析类器官培养的状态及构造，但是这种分析缺少了类器官最重要的分子信息；样本全分析可以在DNA层面、RNA层面、蛋白层面揭示类器官的分子信息，但是只能对整个样本进行分析，达不到单细胞的分辨率，解释不了类器官的发育轨迹和细胞通讯。高通量单细胞测序技术通过对每个细胞遗传物质的分析，在单细胞分辨率下研究细胞的发育、分化，类器官领域的专家们意识到这项技术可以解决困扰他们多年的对类器官进一步应用的问题，比如利用单细胞测序技术从细胞、基因和功能层面分析类器官和真实器官的相似程度，分析类器官的动态转录了解机体的发育分化，解析类器官细胞之间，与周围基质之间的互作等，随即在类器官领域展开了轰轰烈烈的单细胞测序分析，单细胞测序和类器官这两项技术的强强联合已经成为了前沿医学领域的研究热门。
用“Organoid”、“single cell RNA-seq”两个关键词在PubMed(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)上检索标题带有该关键词的文章，从2016年至今共计152篇，其中影响因子在10分以上的文章有55篇。
单细胞测序研究类器官发表文献
单细胞测序技术比较类器官与真实器官的相似程度
利用单细胞测序技术对肾脏类器官与肾脏的比较分析
标题：
Comparative Analysis and Refinement of Human PSC-Derived Kidney Organoid Differentiation with Single-Cell Transcriptomics
期刊：Cell Stem Cell，IF=23.290
时间：2018年
内容：来自人类多能诱导干细胞（iPSC）的肾脏类器官对于研究器官发生和疾病机制具有很大的实用性，并可能作为替代组织来源。本文中作者利用单细胞测序技术比较了来自不同方案的65个类器官和成人与胎儿肾脏，用于分析类器官与真实器官的相似程度。结果发现肾脏类器官细胞类型在与胎儿和成人单细胞数据集进行基准比较时显示类器官细胞是不成熟的。这为类器官诱导方案的改进提供了方向。
单细胞测序技术揭示类器官的发育分化机制
利用类器官单细胞测序揭示人类大脑发育特征
标题：
Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development
期刊：Nature，IF=43.070
时间：2019年
内容：本研究绘制了大脑类器官体的单细胞基因组图谱，从而揭示了人类特异的大脑发育特征。研究人员首先分析了人类全脑器官形成过程中从多能性到神经外胚层和神经上皮阶段的细胞组成，并重建了分化轨迹，然后在背侧和腹侧前脑、中脑和后脑区域内分化为神经元命运。来自不同iPSC品系类器官的大脑区域组成各不相同，但是区域基因表达模式在各个个体之间仍可大致再现。研究人员分析了黑猩猩和猕猴的大脑类器官体，发现与其他两个灵长类动物相比，人类神经元的发育速度较慢。使用分化路径的拟时态比对，研究人员发现人类特异性基因表达沿皮质的祖细胞到神经元谱系解析为不同的细胞状态。染色质的可及性在皮层发育过程中是动态的，研究人员发现人与黑猩猩之间可及性的差异与人特异性基因表达和遗传变化有关。最后，研究人员使用单核RNA测序分析绘制了成年人前额叶皮层中人特异性的表达图，并确定了成年后持续存在的发育差异以及仅在成年大脑中发生的细胞状态特异性变化。这些数据提供了大猿前脑发育的时序细胞图谱，并阐明了人类独有的动态基因调控功能。
单细胞测序技术揭示肿瘤类器官的异质性特征
利用单细胞测序揭示肝胆肿瘤类器官的异质性和耐药机制
标题：
Single-Cell Transcriptome Analysis Uncovers Intratumoral Heterogeneity and Underlying Mechanisms for Drug Resistance in Hepatobiliary Tumor Organoids
期刊：Advanced Science，IF=16
时间：2021年
内容：肿瘤的异质性不仅存在于不同肿瘤之间，还存在于单个肿瘤内部，肿瘤异质性导致癌症信号通路的多样性并驱动表型变异，这对个性化癌症医学提出了重大挑战。本文章作者从4例肝癌、2例肝内胆管癌和1例胆囊肿瘤患者肿瘤组织中分离原发肿瘤进行体外肿瘤类器官的培养，并利用单细胞转录组测序技术揭示肿瘤的异质性和耐药机制。该研究发现具有上皮-间质转化状态的HCC272被证明具有广谱耐药性。通过检查癌症干细胞标记（例如PROM1，CD44和EPCAM）的表达模式，发现CD44阳性群体可能在HCC272中产生耐药性。UMAP和拟时序分析确定了肿瘤内异质性和独特的进化轨迹，其中CTNNB1，甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和NEAT1优势表达簇是常见的跨肝胆类器官。细胞互作分析进一步暗示具有低氧信号富集的代谢优势类器官可上调CD44亚组中NEAT1的表达并介导依赖Jak-STAT途径的耐药性。此外，在多个类器官中共享的代谢优势簇具有相似的特征基因（GAPDH，NDRG1，ALDOA和CA9）。GAPDH和NDRG1的组合是一个独立的危险因素，也是患者生存的预测指标。
单细胞测序技术分析环境对类器官的影响
人脑类器官中的神经胶质细胞多样性和甲基苯丙胺诱导的神经炎症
标题：
Glial cell diversity and methamphetamine-induced neuroinflammation in human cerebral organoids
期刊：Mol Psychiatry，IF=15.992
时间：2021年
内容：甲基苯丙胺（METH）是一种兴奋剂，可以使人愉悦的同时，也可导致认知障碍和神经发育缺陷。本文章作者利用METH处理人类大脑类器官前后的单细胞RNA测序数据来研究METH对胎儿大脑发育的影响。作者对14个大脑类器官进行scRNA-seq，其中6个类器官经METH处理。发现从胚胎干细胞发育的类器官中含有多种神经胶质和神经元细胞类型。进一步发现经METH处理的类器官多种细胞类型（包括星形胶质细胞和神经祖细胞）的转录存在显著变化。METH还引发了新的星形胶质细胞特异性基因表达网络，调节对细胞因子的响应。此外，METH还参与调节神经干细胞增殖、分化和凋亡。最后，作者发现METH可以在RNA和蛋白质水平上诱导神经炎症和细胞因子基因表达发生显著变化。该文章结果说明了人类大脑类器官可以代表一种以单细胞分辨率研究药物诱导的神经炎症的模型系统。
结束语
在最近的几年里，类器官技术经历了相当大的发展。传统的中低纬技术证明了类器官的生理相关性和实用性，而单细胞测序技术的应用有望以前所未有的规模和深度展示高维类器官的特征。近年来，随着单细胞测序技术的发展，已经延伸出了单细胞RNA测序、单细胞ATAC测序、动态转录组测序和空间转录组测序等多组学技术，虽然单细胞技术和类器官研究的结合还不是很纯熟，这两项技术也均处于发展阶段，但是由于这两项技术所表现出来的强大功能，之后的科研人员必定会进一步探索类器官的研究和单细胞测序的发展，最终使得这两项技术完美结合，更高效的为人类医疗服务。
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