单细胞测序技术在黑色素瘤研究中的应用

前言

单细胞技术是现今生命科学领域最热门的技术之一，关于单细胞测序技术在黑色素瘤研究中的应用，相关报道也颇多。黑色素瘤由黑色素细胞发展而来，作为最具侵略性的癌症之一，会给患者带来极大的危害。早在2016年，Garraway团队就已研究最为致命的皮肤癌：黑色素瘤，且于Science期刊上发表，此研究揭示了肿瘤的多样性细胞环境，也对肿瘤中的癌细胞异质性提供了深入的认识。加州大学旧金山分校的科学家在Natrue上发表了一篇关于单细胞技术在黑色素瘤中的应用，结合单细胞测序去探索筛选皮肤癌突变的可能性，依靠细胞分析，可以集中分析皮肤中相对稀疏的黑素细胞，并能够识别癌前突变的细胞。在2020年，美国就有大约10万人被诊断为黑色素瘤，约6850人死亡。同年在Cell上有发表单细胞测序技术分析化疗药物治疗后的黑色素瘤的PDX相关文章，通过探索耐药细胞的细胞异质性等，研究耐药相关的通路及靶点，从而解决肿瘤细胞的耐药问题。可见，单细胞测序在黑色素瘤中的研究已较成熟。近期也有很多文章，报道有关单细胞测序技术在黑色素瘤研究中的应用。

文献一

Single-Cell Immune Mapping of Melanoma Sentinel Lymph Nodes Reveals an Actionable Immunotolerant Microenvironment.

本文通过CyTOF、流式分选和TCR测序对黑色素瘤患者原发性肿瘤前哨淋巴结（SLN）中的免疫细胞进行单细胞分析。结果显示，与非黑色素瘤SLNs相比，黑色素瘤SLNs中的效应记忆αβT细胞TCR克隆性和γδT细胞选择性增加，这与可能激活抗肿瘤免疫反应一致。且作者还在携带黑色素瘤的SLN中观察到明显的免疫耐受环境，表现为NK细胞减少和受损以及CD8+  CD57+  PD-1+ 细胞水平升高，这些细胞已知显示出低黑色素瘤杀伤能力。结果显示这些免疫学变化会损害抗黑色素瘤免疫并导致高复发率。

文献二

Human melanocyte development and melanoma dedifferentiation at single-cell resolution.

表皮黑色素细胞可防御紫外线辐射，并导致皮肤色素沉淀和最致命的皮肤癌黑色素瘤。尽管不同模式生物之间的黑色素细胞发育途径相似，但物种依赖性差异很常见。作者通过获得皮肤中人类表皮黑色素细胞，捕获不同解剖部位、发育年龄、性别和多种肤色的转录组，发现了黑色素细胞亚群。这些亚群表现出妊娠期间发生并持续到成年期的解剖部位特异性富集，且确定了与模型系统生成的基因特征不同的人类黑色素细胞分化转录程序。最后，作者使用这些程序来定义可预测黑色素瘤预后和对免疫检查点抑制剂治疗反应的去分化模式。

文献三

Identification of heterogeneity and prognostic key genes associated with uveal melanoma using single-cell RNA-sequencing technology.

葡萄膜黑色素瘤(UM)是成人最常见的眼内恶性肿瘤。一旦发生转移，预后很差。由于缺乏对这种疾病的生物学特征的深入了解，目前转移性UM的治疗仍然具有挑战性。作者揭示了具有不同功能状态的细胞亚群，以及在异质原发性和转移性UM中存在具有高侵袭潜力的细胞。作者确定了一个与转移性UM相关的新细胞簇作为一种独特的免疫细胞类型。细胞间通讯由“Cellchat”进行，以了解这些免疫细胞与其周围细胞之间的细胞串扰。鉴定出对该细胞群的传出或传入信号贡献最大的关键信号，以揭示关键通路基因。此外，作者根据从癌症基因组图谱下载的数据判断了这些候选者的预后价值。结果表明，增加的IL10、SELPLG、EPHB和ITGB2信号通路可能是UM患者预后的关键因素。作者的发现也为判断是否存在转移或复发的高风险提供了理论依据。

★近期有一篇最新关于单细胞测序技术在黑色素瘤研究中的应用，相关研究结果发表在22年1月13日Nature medicine期刊上，标题为“T cell characteristics associated with toxicity to immune checkpoint blockade in patients with melanoma”。下面我们从研究背景、方法流程、结果、研究结论与展望来讨论关于单细胞测序技术在黑色素瘤患者的免疫检查相关不良事件中的应用。

研究背景

在接受免疫检查点抑制剂(ICIS)治疗的黑色素瘤患者中，高达60%的患者会发生严重的免疫相关不良反应，最严重会导致死亡。研究T细胞特征与免疫相关的不良事件是否有关，将对改进诊断和临床治疗具有重要意义。

方法流程

作者通过scRNA-seq、单细胞V(D)J测序、Bulk RNA-seq和Bulk TCR-seq等方法，对黑色素瘤患者外周血标本进行了研究。确定71名患者进行测试，33人接受抗PD-1单一治疗，38人接受了抗PD-1和抗CTLA-4的联合治疗。大多数患者都经历一个或多个免疫相关不良事件，从轻度(1级)到危及生命(4级)，影响到不同的器官系统，由委员会认证的临床医生根据标准化标准进行分类，并分成3个队列，单细胞发现队列，训练集更大的验证集队列。

结果

1、活化的CD4 T_EM是预处理血液中重度irAEs的决定因素

通过对18名患者的预处理外周血样进行单细胞图谱分析，结果显示只有CD4 T_EM与严重免疫相关的不良事件发展相关的预处理血液中的相关性较高。且CD4 T5+3既实现了与CyTOF计数的CD4 T_EM最高Spearman相关性，也实现与严重免疫相关不良事件发展的最强相关性。进一步分析得出：激活的CD4 T_EM优先导致严重的ICI毒性。

2、活化的CD4 T_EM的TCR丰度是预处理血液中重度irAEs的决定因素

在经历严重的免疫相关不良事件的患者中，活化的CD4 T_EM的TCR克隆多样性增加。这表明，在所有的PBMC中，活化的CD4 T_EM的TCR丰度是导致严重免疫相关不良事件的患者治疗前TCR多样性总体增加的基础。虽然在其他T细胞亚群中，TCR多样性和严重IRAE发生之间的这种联系减弱或不存在，但当结合所有可评估的T细胞，作者观察到预处理样本中的大量TCR多样性和严重IRAE发生之间的显著趋势。相反，与严重的免疫不良事件发展相关的外周血液BCR多样性的差异则不明显。

3、预处理的复合模型可预测出现严重irAEs的时间且外周TCR克隆性扩增与严重的irAEs相关

为检验预处理复合模型是否能预测出现严重irAE的时间，选择一个最佳切入点将患者分为高剂量组和低剂量组。高剂量组患者在治疗开始后的中位数1.74月内出现了严重的irAE，而低剂量组的绝大多数患者未经历严重的irAE。之前有报道关于黑色素瘤患者经历ICI介导的毒性的病例报告，报告显示在受影响的组织中有克隆性扩增的自身或病毒反应性T细胞。将自身和病原体识别的T细胞克隆与致命性毒性联系在一起，本文推测，在ICI治疗开始后，外周血中的TCR克隆型可能会显示出更大的扩增倾向，这些患者注定会出现严重的IRAE。通过immunoSEQ，对15例接受联合治疗的转移性黑色素瘤患者的配对预处理和早期治疗的PBMC样本进行了bulk TCR-β分析。结果显示与未发生严重irAE的患者相比，免疫相关事件严重的患者，TCR持续性克隆扩增，验证了作者的假设。

研究结论与展望

结论与意义循环激活的CD4 T_EM丰度和TCR多样性这两个预处理因素与严重的免疫检查诱导的毒性有关，这对改进诊断和临床治疗具有重要意义。展望本文使用的是库中的临床样本，虽然大多数irAEs发生在ICI治疗开始后的前三个月内，但研究结果是否推广到晚发型irAEs还需进一步分析，且在免疫治疗期间采集治疗外周血液的时间与治疗开始时间并不一致。目前还不清楚此发现是否会推广到其他癌症类型中与ICI相关的irAE风险。若前瞻性验证这些发现，可改善免疫检查点阻断的风险概况，并对ICI介导的毒性的预测和潜在预防产生影响。总结关于单细胞技术在黑色素瘤中的应用已被广泛关注，免疫疗法也为不同类型的癌症带来重大突破。随着免疫疗法的热潮，免疫治疗相关不良反应也逐渐被人们发现与关注。在未来的几年里，新药物将继续进入临床，随着研究的深入，可以获取更多临床用药的有效信息，最终为患者的健康保驾护航！

参考文献

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[5] Alexander X., Lozano, Aadel A. et al. T cell characteristics associated with toxicity to immune checkpoint blockade in patients with melanoma. Nature Medicine, 2022.

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