项目文章 | 髓核的单细胞RNA测序揭示椎间盘退变中软骨细胞的分化和调节
继2021年7月利用6例单细胞转录组测序样本发表一篇椎间盘退变文章后，青岛大学附属医院脊柱外科马学晓教授团队再次发表另一篇文章，新格元在两篇研究文章中承担了单细胞转录组测序、分析等工作，利用新格元自主研发的Singleron Matrix®自动化单细胞测序文库构建系统完成文库构建，CeleScope™生信分析软件及SynEcoSys®单细胞数据库完成专业的生物信息挖掘和精确的细胞类型注释。
之前的研究发现【单细胞测序揭示椎间盘退行性变中独特软骨细胞亚群及发病机制】铁死亡参与了IVDD的发病机制，为IVDD发病过程中的病理变化提供了新的见解。本次研究通过同样的6例单细胞转录组样本，不同的分析角度，为潜在的椎间盘退行性病变治疗靶点提供了新的研究路径。
研究结果
1、IVDD中NP细胞的组成
髓核(NP)是一种异质性组织，是椎间盘的重要功能成分。然而，NP细胞在椎间盘退变(IVDD)中的发育途径和调控机制仍不清楚。为了研究细胞多样性，对六例NP样本进行了scRNA-seq分析，其中5名具有不同严重程度的IVDD（轻度退变IVDD-M: NP4, NP9, NP10和重度退变IVDD-S: NP2, NP8），以及1名没有IVDD（NC）的脊髓损伤患者（图1A）。对30,300个细胞聚类分析共获得三大类细胞类型，包括软骨细胞（主要表达SOX9, ACAN,和COMP）、内皮细胞（EC,主要表达PECAM1,CD34,和PLVAP）和巨噬细胞（CD74,TYROBP,和LAPTM）（图1B,C）。软骨细胞可分为三个经典的细胞群：软骨祖细胞（CPC），纤维软骨细胞祖细胞（FCPs）和稳态软骨细胞（HomCs），以及四个新细胞亚群C1-4（图1D，F）。接下来，比较了各组亚簇的分布（图1E），发现样本中软骨细胞占多数，而EC和巨噬细胞仅少量存在于IVDD-M和IVDD-S中，这与IVDD中的炎症反应和血管生长现象一致。有趣的是，还发现三个软骨细胞亚簇与IVDD过程有关。C1在NC组中很少出现，而它是退变组样本中最常见的软骨细胞亚型。然而，随着IVDD的进展，CPCs的比例急剧下降。此外，C3仅在退变组样本中发现，IVDD-S组的比例高于IVDD-M组。
2、软骨细胞类型特征
软骨细胞分泌胶原蛋白和蛋白多糖等细胞外基质（ECM），这是NP的结构和功能所必需的。GO分析发现C1高表达FGF2、HMOX1、CXCL8和CXCL2等基因，具有调节血管发育、抗菌体液反应和过渡金属离子稳态等功能(图2A)。C2与胆固醇生物合成过程有关，C3参与细胞外基质分解，C4有利于组织重构(图2B，D)。综上所述，C1和C3被归类为炎症反应亚群。C2高表达II型胶原和蛋白多糖，有助于保持ECM的正常结构。C4具有类似成纤维细胞的表型，可能有助于ECM重构。
研究还发现，CPC、FCP和HomC在IVDD中显示不同的功能。CPC作为NP来源的祖细胞/干细胞，特异性表达TOP2A,CENPF和BIRC5，所有这些都与染色体分离和有丝分裂有关（图2E）。细胞周期的注释表明，CPC中G2/M期的比例显著高于其他亚群，表明其较强的增殖能力（图2I）。FCP相关基因TRIB3和CANX与蛋白质折叠质量控制和内质网应激有关（图2F）。HomC具有显著的应激反应能力，例如对错误拓扑蛋白质的反应，对温度刺激的反应以及对TGFβ刺激的细胞反应。FOS/JUN作为转录因子（TFs），在调节HomC对应激的反应方面至关重要（图2G）。
3、软骨细胞亚群的转录调控
单细胞调控网络分析显示，几个转录因子（TF）在不同的亚簇中富集（图3A）。在C1和C3中，NF-κb家族（NFKB1、NFKB2和REL）显示调节活性增强，这与炎症反应亚组一致，另外，C3中FOSL1及其靶基因（包括MMP2、MMP3和MMP13）显著上调，具有较强的细胞外基质降解能力。C4中的转录因子TCF4活性更高，这可能导致C4的纤维化特征。TFDP1、BRCA1和MYBL1是CPC特异性转录因子，在细胞周期和DNA损伤修复控制中发挥重要作用。此外，SCENIC结果显示HomC中转录因子JUN和FOS的调控能力高，这与GO分析一致（图3B、C）。因此，通过研究潜在的上游调控因子，将有助于理解NPCs的异质性及其在IVDD中的作用。
4、软骨细胞的拟时序分析
软骨细胞表达模式的变化与IVDD的发生密切相关。通过Monocle研究IVDD发展过程中NP中软骨细胞的转化。轨迹起始部的细胞标记为R-C，fate1中的细胞标记为F1-C，fate2中的细胞标记为F2-C（图4A）。CPC多分布于起始部附近。C1主要沿两条细胞命运轨迹分支分布，C3和FCP主要占据两条细胞命运轨迹分支的末端，C2、C4和HomC沿整条轨迹均匀分布（图4 C）。图4D发现，随着疾病的进展，R-C的比例逐渐下降，而F1-C和F2-C的比例稳步上升。总的来说，这些结果表明软骨细胞亚群在软骨细胞命运分化曲线中的分布能够反映IVDD的病理过程。
接下来，利用轨迹分析的结果，解构了样本基因转化模式，以研究其对细胞命运改变的精确影响(图4E)。这些基因被分为四个不同的簇。簇A包括PMAIP1、CCL2、CXCL2和ICAM1等基因，与病毒防御反应、I型干扰素信号通路、TNF的细胞反应相关，在向fate2过渡过程中显著升高。同时，簇C和D基因主要包括ECM重构相关基因（MMP2、MMP3、POSTN和COL1A1），也向fate2方向增高表达。簇B基因主要包括正常ECM相关基因(COL2A1和ACAN)，在向fate1过渡的过程中显著增强表达(图4E-G)。
5、NPC不同细胞命运反映了IVDD发展的格局
为了深入了解IVDD背后的机制，使用GSVA来表征R-C，F1-C和F2-C功能，并使用SCENIC来发现候选TF。
R-C高表达基因主要富集于细胞周期和氧化磷酸化（图5E）。然而，当细胞分化为两种细胞命运时，调控细胞周期和细胞分裂的TF（TFDP1、BRCA1和MYBL1）的表达减少（图5F，G）。F1-C高表达基因主要富集于蛋白质靶向、翻译起始和核糖体生物合成（图5E）。值得注意的是，在此阶段产生的ECM主要由II型胶原和蛋白多糖（由COL2A1和ACAN编码）组成，是正常的ECM成份，而MMPs和ADAMTs的表达极少（图5D）。研究还发现，SCENIC预测的控制COL2A1和ACAN的特殊转录因子（FOSB和SOX9），在F1-C中显著表达（图5F–H）。F2-C高表达基因富集于ECM组织和ECM降解中，包括COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP13,CXCL8和 CXCL2等，代表其对于退变过程中ECM重构的重要作用。高表达的TF包括NFKB1, FOSL1, IRF1和REL，而F2-C中的TNF、NF-κB、MAPK、IL17和I型干扰素信号通路增强，可引起这些TF的上调或激活（图5E–H）。综上所述，这些数据表明了控制IVDD中各种细胞命运的TF和信号通路，有助于更好地理解疾病机制。
6、构建基于细胞命运的IVDD细胞通信网络
配体受体对通过维系细胞间通讯影响细胞功能和命运，促进或抑制疾病的发展。在该研究中，巨噬细胞和EC只在IVDD组中被发现，与病程密切相关，故利用CellPhone DB来研究不同细胞命运下软骨细胞和巨噬细胞和EC之间的潜在联系(图6A)。总的来说，细胞间通讯分析表明软骨细胞，巨噬细胞和EC之间的信号串扰：F1-C中，细胞间生长因子（GF）信号交流更活跃，可以维持软骨细胞的正常发育。相反，在F2-C中，巨噬细胞和EC与软骨细胞在炎症、凋亡等方面的细胞间作用活跃，这可能是IVDD发展的关键因素。
结论
总之，该研究单细胞测序数据从单细胞的角度提供了IVDD中NPC的详细转录组数据，通过识别关键细胞亚群、信号通路和TFs，阐述细胞的分化方向，模拟细胞间的相互作用，证实了既往的发现，并为潜在的治疗靶点提供了新的研究视角。
参考文献