Bioconjugate Chem.∣肽组装体用于模仿分子伴侣实现蛋白质转运

大家好，今天给大家分享一篇最近发表在Bioconjugate Chem.上的研究进展，题为：Peptide Assemblies Mimicking Chaperones for Protein Trafficking.文章的通讯作者是美国布兰迪斯大学（Brandeis University）的徐兵（Bing Xu）教授。

一般来说，形成肽组装体（Peptide Assemblies）的肽大多数是中性，两性离子或带正电的。带负电荷的肽（negatively charged peptide, NCP）的自组装很少受到关注。在自然界中，许多蛋白质的固有无序区（intrinsically disordered regions, IDR）存在带负电荷残基的重复序列（例如，富含谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）的重复序列），发挥出与核酸相关联的功能。例如相关研究工作表明，核糖蛋白（nucleoplasmin，NPM）是一种高度保守的组蛋白伴侣（histone chaperone），它形成五聚体，通过NPM的负电荷重复序列结合组蛋白2A（H2A）和组蛋白2B（H2B），并以H2A / H2B二聚体形式转运到核中。

在本文的工作中，作者基于对短肽自组装的结构理解，开展研究负电荷的肽（NCP）组装的功能，模拟蛋白质伴侣，以调节蛋白质的运输。研究表明，含有谷氨酸重复序列（EGEGEEEEE）的肽段（NCP1）在溶液中形成胶束状组装体，其构象在中性或碱性pH下主要以无序和α-螺旋构象组成。 NCP1的组装对细胞无害，能够与核糖蛋白（NPM）竞争，将H2B运送到线粒体（图1）。

图1. 负电荷的肽（NCP1）的结构和组装体示意图，与核糖蛋白（NPM）竞争，将H2B运送到线粒体示意图。

作者从NCP1肽结构出发，通过控制变量，设计了NCP2-NCP9的一系列NCP1类似物，系统地阐述了以下规律：（1）自组装，谷氨酸重复序列和特定立体化学这三个因素是NCP1能够转运H2B的必需条件；（2）支化谷氨酸重复序列与线性谷氨酸重复序列一样有效；（3）天冬氨酸重复序列的组装体也将H2B运输到线粒体。为更好地理解这三点结论，我们来详细解读图2的分子设计。

首先，为了使NCP能够自组装并最大程度降低细胞内的蛋白水解，作者将Nap-_D-Phe-_D-Phe序列（简写为Nap-ff，该序列的二苯丙氨酸结构存在强的芳环-芳环相互作用，可驱动自组装）连接到EGEGEEEEE序列，得到NCP1。NCP1的组装体将与组蛋白伴侣竞争转运组蛋白。

用乙酰基（Ac）取代NCP1中的Nap-ff形成NCP2，则NCP2将缺少对自组装至关重要的芳环-芳环分子间相互作用。从NCP1去除EEEE会导致NCP3的酸性氨基酸减少。将NCP1中的_L-谷氨酸转变为_D-谷氨酸，得到不同的立体化学的NCP4。将NCP1主链中的最后四个谷氨酸换到侧链上，得到具有分支几何形状的NCP5。NCP6具有天冬氨酸（D）重复序列。NCP7使用_D-天冬氨酸代替NCP6的_L-天冬氨酸。作者使用硝基苯并呋喃（nitrobenzofurazan, NBD）代替NCP1的Nap，得到NCP8。采用NBD官能团封闭NCP1的C端，得到NCP9。作者希望这些结构上的变化将阐明NCP的每部分结构对应的功能（图2）。

上述结构设计都是围绕NCP1进行的，那么首先介绍一下NCP1的性质。NCP1在pH7.4的水溶液的临界胶束浓度（CMC）为145 μM（图3A）。圆二色谱分析表明pH值升高有利于肽以无序和α螺旋构象分布（图3B）。透射电子显微镜（TEM）显示NCP1分别在pH 7和pH 9时具有直径为13±2 nm和14±2 nm的纳米颗粒（图3C），表明NCP1在PBS缓冲液中自组装形成胶束。并且NCP1对细胞几乎没有明显毒性。

图2. NCP1的类似物（NCP2-NCP9）的结构。

图3. NCP1的理化性质表征。（A）临界胶束浓度；（B）二级结构分析；（C）TEM图像。

为验证NCP1的组装体是否具有转运蛋白功能，作者将NCP1与表达H2B-RFP（红色荧光蛋白标记的H2B组蛋白）的HeLa细胞共孵育。如图4所示，未与NCP1孵育的HeLa细胞在细胞核中显示出H2B-RFP的红色荧光。与NCP1以100 μM孵育后，转染H2B-RFP的HeLa细胞表现为两类，一部分细胞在核中带有H2B-RFP，而其他细胞在线粒体中带有H2B-RFP。将NCP1的浓度增加到200 μM，则H2B-RFP仅在线粒体定位（图4）。

图4.（A）0 μM，（B）100 μM和（C）200 μM的NCP1孵育24 h的HeLa细胞的荧光图像。

图5的实验将NCP2至NCP7与HeLa细胞孵育，来阐明了自组装，负电的重复序列，立体化学，支化结构和其他酸性氨基酸残基的作用。实验结果表明，NCP2孵育后H2B-RFP几乎不定位于线粒体，分析指出NCP2的疏水性不如NCP1，导致自组装驱动力下降，反映了NCP的自组装行为是转运H2B的必需条件。NCP3和NCP4均无法实现转运H2B，分别表明具备重复谷氨酸序列和序列立体化学的重要性。NCP5可转运H2B，表明改变线性结构为支化结构影响不大。NCP6和NCP7的现象分别类似于NCP1和NCP4（图5）。

图5.与NCP2-7（200 μM）孵育24 h的HeLa细胞的荧光图像。

总结来说，本文针对短肽自组装的结构，系统地开展了负电荷的肽（NCP）组装用于模拟蛋白质伴侣，调节蛋白质运输的研究。

作者：WH    审校：WYY

Yang, D. et al., Bioconjugate Chem. 2021, 32, 502-506.

Link: https://dx.doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.1c00032