Bioconjugate Chem.∣基于聚合物载体的RNA干扰技术用于抑制甲状旁腺激素的产生

大家好，今天给大家分享一篇最近发表在Bioconjugate Chem.上的研究进展，题为：Polymeric RNAi Constructs Tailored with Appreciable Transcellular Trafficking Functions for Potential Suppression of Parathyroid Hormone Production. 文章的通讯作者是厦门大学附属中山医院的陈兰主任医师。

RNA干扰技术（RNA interference, RNAi），尤其是小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA），可通过基于基因组序列的识别实现降解目标mRNA。siRNA作为一种阴离子型的大分子，无法进行被动扩散通过细胞膜，因此需要合适的递送策略来克服细胞质膜的运输障碍。阳离子型聚合物和脂质体与带负电的siRNA通过静电相互作用形成复合物，但由于siRNA电荷数量较低，导致静电相互作用能力不足，得到的复合物的稳定性较差，导致RNAi效率受到限制。

为解决这一问题，在本研究中，作者合成了一种类似透明质酸的聚氨基酸，并将siRNA共价修饰到聚氨基酸的侧链上，以实现优异的生物相容性和细胞膜亲和力，提高siRNA的入胞效率（图1）。此外，这一带负电荷的类透明质酸的聚氨基酸在酸性内体中发生特异性水解，发生电荷反转，转化为带正电荷的材料，增强了溶酶体逃逸能力，实现高效胞质溶胶的转运。并且，siRNA通过二硫键偶联，这一方法使得细胞溶胶中的强还原环境（高水平谷胱甘肽）特异性地加速siRNA的释放，产生有效的RNAi疗效。作者评估了这一siRNA构建体与最常用的商业化siRNA转染试剂，在抑制癌细胞基因表达中的RNAi功效的性能对比，并进一步探索其在治疗顽固性甲状旁腺功能亢进症中的潜力。

图1. 类透明质酸的聚氨基酸PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的合成路线。

作者首先以β-苄基-L-天冬氨酸N-羧酰酐（BLA-NCA）的开环聚合合成了聚天冬酰胺骨架。随后，侧链与二亚乙基三胺（DET）进行氨解反应，生成具有一系列胺基的聚{N- [N'-（2-氨基乙基）-2氨基乙基]天冬酰胺} [PAsp（DET）]。此外，通过伯胺与DBCO-NHS的NHS基团反应，将DBCO基团引入到合成的PAsp（DET）中。随后为了组装类似于透明质酸的结构，与2-丙-3-甲基马来酸酐（CDM）反应，将生成的PAsp（DET-DBCO）中的剩余伯胺完全转化为羧基[PAsp（DET-DBCO＆CDM）]。需指出，在最后一步siRNA药物负载的反应中，NHS-SS-N₃连接子（azido-PEG₃-SS-NHS）与siRNA（5'-amino-siRNA）通过氨基-活化酯反应实现偶联，即得到叠氮基团N₃修饰的siRNA，再与[PAsp（DET-DBCO＆CDM）]中引入的DBCO官能团通过点击化学反应完成siRNA的负载，制备得到最终产物PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]（图1）。

作者验证了聚氨基酸负载siRNA的稳定性。相比于未修饰的siRNA，PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]耐受血清中的核糖核酸酶的降解性能更为优越（图2）。

图2. PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的抗降解性能。

天然siRNA由于其本质上对细胞膜的亲和力差而几乎不能入胞。在本研究中，作者构建的PAsp [DET-DBCO（-ss-siRNA）＆CDM]旨在通过拥有一系列羧基单元来模拟透明质酸的特征。作者推测，对于细胞膜外表面上的多种糖胺聚糖， PAsp [DET-DBCO（-ss-siRNA）＆CDM]，对这些膜锚定的糖胺聚糖具有一定的粘合亲和力（例如氢键）。为验证这一猜想，作者采用胃癌细胞SGC-7901进行细胞摄取实验。结果表明，PAsp [DET-DBCO（-ss-siRNA）＆CDM]具有极好的摄取效果（图3a）。鉴于透明质酸的细胞粘附源于CD44的特异性受体，因此作者研究证明了CD44起重要作用，分别使用CD44低表达的MCF-7细胞作为阴性对照，以及预先用透明质酸饱和细胞膜表面CD44受体，后者的操作使得PAsp [DET-DBCO（-ss-siRNA）＆CDM]的细胞摄取大幅下降（图3b）。

图3. PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]的细胞摄取。图b采用不同浓度的透明质酸与细胞预孵育。

PAsp [DET-DBCO（-ss-siRNA）＆CDM]内化进入细胞后，首先将位于溶酶体中。此时，溶酶体的酸性环境使得CDM酸酐发生酸响应脱除，则原本呈负电的载体发生电荷反转后呈正电性，促进溶酶体逃逸。此外，细胞溶胶内高GSH浓度使得连接siRNA处的双硫键发生还原断裂（图4）。

图4. pH和GSH响应双重功能促进siRNA的胞内递送。

除癌细胞外，作者继续使用这一RNAi构建体来测试其在甲状旁腺功能亢进症治疗中的潜在用途（图5）。甲状旁腺功能亢进症被认为是甲状旁腺的一种严重疾病，在血液中持续产生高水平的甲状旁腺激素。

总结来说，作者合成了一种类似透明质酸的聚氨基酸，并将siRNA共价修饰到聚氨基酸的侧链上，以实现优异的生物相容性和细胞膜亲和力，提高siRNA的入胞效率。

图5. 甲状旁腺激素mRNA的降解和甲状旁腺细胞中的表达抑制作用。

作者：WH    审校：HYL

DOI:10.1021/acs.bioconjchem.1c00164

Link: https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.1c00164