【应用案例】解析染色体结构变异

许多研究都将结构变异体与常见和罕见的人类疾病联系在一起, 表型包括了认知功能障碍、肥胖症和癌症易感性以及其它病症。

短读长测序在分析结构变异和重复区域研究中的局限性已经得到了完整的记录与证明，长读长测序在需要对结构变异精确分析的应用中具备优势，可提供更完整的遗传多样性见解。纳米孔测序的读长长度等于DNA或RNA片段长度，已取得超过2Mb的超长读长。显然，这种长读长序列更可能跨越重复DNA和SVs的整个区域，能够提供一个更完整的遗传变异视角。此外，随着研究人员寻找新型疾病关联，单倍型定相（确定DNA片段的染色体源）越来越受关注，定相还可以解析复合杂合性，即特定基因或区域的两个等位基因具有不同的变异。

实际案例一

染色体碎裂分析

染色体碎裂现象是结构变异的一种极端例子，其中有限数量的基因组区域在一次灾难性事件中获得数百个染色体重新排列。这种事件已经在癌症和先天性疾病中出现。长读长测序非常适用于分析这种大面积结构变异。

乌特勒支医学中心Wigard Kloosterman博士的团队采用纳米孔测序对极其复杂的胚系染色体碎裂现象进行测序。纳米孔测序可识别所有断点，这些断点之前通过采用传统短读长技术的双端测序对mate-pair文库进行表征。该团队扩大研究范围检查全基因组结构变异时,发现长读长数据和短读长数据的结果具有一致性。但是，长读长数据还能鉴别出短读长数据未检测出的许多其他变异体（图1), 进一步突出了短读长分析鉴别结构变异体的局限性。纳米孔长读长测序的另一个优势为，能够确定染色体碎裂样本的单体型分期，从而证实父本染色体碎裂现象。

图1. 纳米孔长读长测序能够明确识别出大片段缺失情况，这一点在使用传统的短读长测序技术时效果不明显。数据由荷兰乌特勒支医学中心的WigardKloosterman博士提供。

实际案例二

解析染色体复杂结构变异

“

读长全基因组测序是研究重复区域断裂点分析的最佳技术。

”

英国剑桥大学的Alba Sanchis-Juan及其同事正在研究cxSV与孟德尔疾病的关系。他们使用短读长测序技术筛查了来自神经发育或视网膜疾病患者的1342份样本，以确定与临床重要、疾病相关基因重叠的cxSV。在鉴定出的四个样本中，除一个样本外，其他所有样本均可以通过结合短读长测序、Sanger测序和微阵列分析来解析变异的性质。未解析样本的数据来自一位患有胎儿心动过缓（低心率）的女性新生儿，该数据表明cxSV结构存在两种选择性模式，其中基因CDKL5的一或两个断裂拷贝与早期婴儿癫痫性脑病相关（图2）。

为了表征cxSV的真实性质和可能的致病性，研究小组转向纳米孔技术提供的长读长测序功能。使用纳米孔低通全基因组测序方法，所有断裂点的覆盖度至少达到了4X，平均读长长度为8kb。长读长可以确定异常位点的定相，从而确定了父系遗传。定相后的读长也确定了CDKL5基因完整断裂拷贝的存在，这为拟议的模式提供了支撑证据（图2）。此外，纳米孔测序证实了由于DNA的重复性，而无法使用Sanger测序阐明的所有新断裂点位点，导致无法设计特异性引物。随后的基因表达分析表明， CDKL5的两个等位基因均在样本中表达，表明该变异可能是良性的。

图2. 使用纳米孔测序精确解析新生儿样本中的cxSV。短读长测序技术检测到一个与CDKL5重叠的“重复—倒位—重复”事件，但无法在cxSV结构和形成的两个模式之间进行解析。长纳米孔测序读长允许准确的定相和断裂点解析，从而确认存在一个完整的和一个断裂的CDKL5 拷贝，并支持拟议的模型1。蓝色 = 重复；绿色 = 倒位。图片改编自Sanchis-Juan等人。

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参考文献：

[1] Sudmant, P.H.等人（2015). 2504个人类基因组结构变异综合图. 自然, 2015年10月1日; 526 (7571): 75-81. doi:10.1038/nature15394

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[11] Sanchis-Juan, A. Complex structural variants resolved by short-read and long-read whole genome sequencing in Mendelian disorders. Presentation. Available at: https://nanoporetech.com/resource-centre/complex-structural-variantsresolved-short-read-and-long-read-wholegenome-0 [访问于2018年10月30日

延伸阅读

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