NGS测序原理梳理03-边合成边测序

继上一步簇在flow cell上生成后，下一步就开始测序。

illumina 测序原理

边合成边测序（sequence by synthesis，SBS），过程如下图（不同测序仪的dNTP荧光基团有差异，分4通道和2通道两类），共3步：

1. dNTP连接；

2. 扫描照相；

3. 切除叠氮基和标记的荧光基团；

• 1）4通道测序仪SBS原理

上图详解

• dNTP连接

在聚合酶的作用下，某一种dNTP会结合到链上，叠氮基的存在使得一次只能连接一种dNTP；

• 扫描照相

剩余的dNTP和酶被冲掉，将Flow cell进行扫描照相，所得荧光对应的碱基即是该位置的碱基；同时在该Flow cell上有成千上万个cluster也在进行同样的反应，一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）；

• 切除叠氮基和标记的荧光基团

这个循环完成后，加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉，进行下一个循环（碱基的连接、扫描照相与切除）。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出，也就是Read1 序列。

• 2）2通道测序仪SBS原理

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测序过程

杂交Read 1 引物

将Read1测序引物，四种dNTP（ATGC）和DNA聚合酶加入流动槽，测序引物与adapter中的互补引物杂交；

• dNTP特点：

• 被荧光基团标记，每种碱基标记的荧光基团不一样（具有独特的荧光波长，会发出不同颜色）；

• dNTP 3’末端连了一个叠氮基，这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连，一次只能连接一个dNTP。

正义链测序 

• 测序

• 洗脱

测序生成的片段被变性洗脱掉，正义链测序完成

index1测序

• 测序

index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对，进行index1的合成及检测。

• 洗脱

测序生成的index1片段被变性洗脱掉，index1测序完成。

去掉成簇时所阻断的3'端

index2测序

• 测序

• 洗脱 

桥式扩增反义链

• 扩增

以Flow cell上的P5 互补链为引物，Forward strand为模板进行桥式扩增，得到双链。

• 双链变性 

正义链被切除

反义链测序

类似正义链测序，至此测序步骤结束

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数据分析 

根据index获得每个样本的fastq格式测序数据或者bcl格式（Nextseq500下机数据为bcl格式），步骤如下：

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参考资料 

https://www.bilibili.com/video/BV15s411t7SJ

https://www.bilibili.com/video/BV1ht411q7Wh

https://www.illumina.com.cn/

至此，illumina 测序的文库构建，簇生成，边合成边测序及数据拆分结束，点击会看：

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