塑料降解回收利用最新Nature

▲第一作者：Hongyuan Lu

通讯作者：Hal S. Alper

通讯单位：美国德克萨斯大学奥斯汀分校

DOI：https:// doi.org/10.1038/s41586-022-04599-z

01
研究背景

近年来，塑料垃圾的泛滥带来了严峻的生态挑战，而酶降解工艺为聚酯废物的回收提供了一条潜在的绿色和可扩展的途径。聚对苯二甲酸乙二酯(即PET， PET占全球固体废物的12%)，理论上可以通过快速酶解聚然后再聚合或转化成其他产品以实现PET的循环碳经济。然而，现有的PET水解酶的工艺因其对pH和温度十分敏感、缺乏稳定性、反应速度慢以及不能直接用于未经处理的塑料而受到很大的限制。

02
研究问题

本文使用一种基于结构的机器学习算法来设计一个强力和高效的PET水解酶。本文发现的突变体和支架组合与野生型PETase相比存在五个突变，而且在30至50℃和一系列pH值范围内显示出比野生型和其他工程替代物更加优越的聚酯水解酶活性。本文证明，来自51种不同热成型产品的未经处理的、消费后的塑料都可以在1周内被FAST-PETase几乎完全降解。FAST-PETase还可以在50℃下解聚未经处理的无定形的商用塑料水瓶。最后，本文展示了一种通过使用FAST-PETase并从回收的单体中重新合成聚酯的闭环聚酯回收工艺。总而言之，本文的结果证明了一条在工业规模上进行酶促塑料回收的可行途径。

03
图文解析

▲图1|机器学习指导的预测提高了PETase支架上的酶性能。

要点：

1. 本文使用MutCompute获得了WT PETase和ThermoPETase(晶体结构为PDB 5XJH和6IJ6)中的每个位置的所有20个典型氨基酸的结构拟合的离散概率分布，并且基本上进行了silico comprehensive mutagenesis scan。预测的分布呈现在蛋白质晶体结构上(图1a)，用以确定WT氨基酸残基与潜在的替代基的适合位置。然后，根据预测概率(拟合的折叠变化)对预测进行排名(图1b)。使用逐步组合策略，总共产生了159个单一或几个预测突变体。本文还进一步鉴定了表现出更好的催化活性(通过酯酶活性和塑料降解率来衡量)和热稳定性(通过蛋白质熔化温度Tm来衡量)的变体。在其中一组中，本文发现四个突变(S121E、T140D、R224Q和N233K)(图1b)产生了最高的性能提升，因此将用于下文的进一步的组装和分析。

2. 本文使用文献中常用的非晶聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜来评估这些更稳定的变种在30到60 ℃的温度范围内的聚酯水解性能。结果表明，利用机器学习指导的得到的变体极大地增强了活性，并扩大了所有支架的工作温度范围(图1c)。在相同的温度下，PETase^{S121E/R224Q/N233K}的PET水解酶活性分别是WT PETase和ThermoPETase (图1c)的3.4倍和29倍。

▲图2|WT和赖氨酸突变酶的热稳定性和PET水解活性。

要点：

本文研究了使用替代PHE的基于机器学习的预测的可移植性和普适性。为此，本文选择了N233K突变体，并将这个相应的赖氨酸突变引入到LCC、ICCM和绿色糖单胞菌AHK190的角质酶样酶Cut190中。由此产生的Cut190和LCC的赖氨酸突变体(LCC^D238K和Cut190^D250K)都显示出比它们各自的支架(图2a)显著增强的热稳定性(ΔTm=7℃)，而ICCM的赖氨酸突变体(ICCM^C238K/C283S)的Tm为96.3℃，降低了3.7℃。更重要的是，这三个赖氨酸突变体对无定形gf-PET的水解活性都显著高于它们各自的支架(图2b)，从而显示出突变的可移植性。

▲图3|FAST-PETase在热成型PC-PET产品解聚中的卓越性能。

要点:

1. 本文收集了51个用于食品、饮料、药品、办公用品、家居用品和化妆品包装的使用后的塑料产品样本，并在50℃下用FAST-PETase对这些原材料进行了酶处理。尽管这些样品在结晶度、相对分子质量、厚度和添加剂上是不同的，但是来自如此广泛的聚酯产品的打孔样品都在1周内甚至在24h内被FAST-PETase完全降解(图3a)。

2. 对装过豆饼的塑料样品进行的时程分析(图3b)显示，在16h后，其结晶度从1.2%增加到7.7%，几乎呈线性衰减。AFM(图3c)以及SEM进一步展示了FAST-PETase的反应进程，因为它在PC-PET表面产生越来越深和更大的孔，最终导致在反应过程中表面粗糙度(和不透明度)增加。

3. 本文还证明，只需增加净反应体积，这种由快速PETase激活的解聚就可以很容易地扩展到大块、未经处理的塑料(最高可达6.4g)(图3d)。

▲图4|用FAST-PETase解聚PET水瓶和聚酯产品的结果和FAST-PETase在PET酶化学回收中的应用。

要点：

1. 为了更全面地评估商业水瓶的酶解聚，本文测定了瓶子不同部分的结晶度，发现瓶口/颈部和底部中心相对无定形(结晶度分别为1.2%和11.7%)，而瓶的其余部分是高度结晶的(结晶度为25.9-33.8%)(图4a)。为了评估水瓶的原始、未经处理的部分的可生物降解性，本文从这些区域提取打孔的片段，并在50℃下用FAST-PETase处理24h。结果(图4b)显示，在末端/颈部和底部中心区域实现了大量单体的释放，而瓶的其余部分只释放了微量的单体(0.09至0.14mM)，因此表明高结晶度对酶解聚速率有负面影响。

2. 本文还比较了FAST-PETase和其他PHE在50到72℃的温度范围内的水解性(图4c)。这些结果表明，FAST-PETase能够有效地解聚处理过的塑料瓶薄膜，在50℃下24h释放出32.8mM的聚酯单体，是所有PHE和温度组合中是最高的。

04
小结

鉴于该FAST-PETase突变体在室温和特定pH条件下具有较高的活性，本文认为该酶适合于对PET进行酶化学加工。PET解聚只是循环塑料经济的一半，本文在这里展示了一种闭合的循环PET重建方案：首先使用FAST-PETase解聚使用后的塑料垃圾，然后回收单体并重新聚合成纯净的PET；从降解液中回收TPA，收率为94.9%，纯度97%以上；最后，使用化学聚合方法直接从降解液中再生PET。从降解到再聚合的完整循环可以在短短几天内完成，本文证明了闭环的酶/化学循环过程的可行性，以从非石油资源中生产出透明、无污染的PET薄膜。此外，这一工艺流程绕过了回收混色PET产品的挑战。总的来说，这些结果展现了基于结构的机器学习在将嗜温酶支架转化为广域生物催化剂以实现循环塑料经济方面的应用前景。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04599-z

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