高效液相色谱-Part8：检测器（2）
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上次我们讲了紫外-可见光检测器（UV-Vis）和二极管阵列检测器（DAD），这两个检测器是最常用到的检测器。那这一期我们要讲讲剩下的几个不常用的检测器。
示差折光检测器的英文全称是Refractive Index Detector，RID检测器。介绍检测器之前我们先来了解了解示差折光这一概念。
当一束光穿过一种介质进入另一种介质时，其波速和方向会发生改变。方向上的改变称为折射。入射角和折射角的关系表示为斯涅尔折射定律。大家学物理的时候都应该学过。
图一：折射定律
从下面的图片以及公式可以看出，外部小偏转角与介质 1 和介质 2 的示差折光差成正比。
图二：折射图
图三：偏转角公式
影响示差折光的因素
一种介质的示差折光受到多种因素的影响：入射光的波长以及介质
1 波长
示差折光随着入射光束的波长变化而变化。
2 介质
当介质的密度发生变化时，示差折光会随之变化。在入射光波长固定的情况下，示差折光的变化通常与介质密度的变化成线性关系。而影响介质的密度的因素有：组成（如果是非纯物质），温度，压力。
我们可以想想，示差折光检测器，示差才是重点。示差折光检测器是一种差示折光计，可以测量因单个流通池的样品池和参比池中液体的示差折光不同而引起的光束偏转程度。
灯发出的光束会穿过流通池，流通池沿对角线分成样品池和参比池。在流通池的后面有一个反光镜，可以将光通过零点玻璃和流通池（影响光束的光路）反射回光线接收器。光线接收器具有两个二极管，每个二极管都可以产生与照射到二极管的光线总量成正比的电流。
1）
图五：示差折光检测器原理图（2）
在开始实验之前，使用流动相冲洗样品池和参比池。然后关闭参比池，让溶剂仅从样品池中流过。流动相在两个池中的示差折光相同，并且可以调整零点玻璃的位置，使检测器可以达到光平衡，让每个二极管获得同样的光线量。当样品经过色谱柱的洗脱流入样品池时，样品池中的内容物的示差折光就会发生变化。示差折光的变化会造成光束通过流通池时发生偏转，结果使两个二极管获得的光线量不相等。此操作所造成的二极管电流变化经过放大后可以用于生成经过校正的检测器信号。该信号与样品池中的样品和参比池中的流动相的示差折光差异相对应。个人认为下图中的空白光路图（左边）太过理想化，其实光路也应该有点偏转，然后通过准直镜（零点玻璃）校准，使得两个光电二极管产生相同的光向量。
图六：空白与样品光路偏转对比图
可能有的同学已经注意到了，上述描述中有一个仪器的平衡过程：使用流动相冲洗样品池和参比池，然后关闭参比池，让溶剂仅从样品池中流过。这个过程是如何实现的呢？不要着急，我们慢慢讲！这个问题其实不是检测器的问题，它涉及到的是整个流路的设计！
RID检测器的仪器流路图
色谱柱洗脱液沿入口进入光学设备，并通过一个换热器。换热器和光学设备温度控制的结合使用，可以在高于环境温度 5 °C 到 55 °C 之间的范围内，将温度变化所造成的示差折光变化降至最低。洗脱液流过样品池，通过同一个换热器进入吹扫阀。当吹扫阀处于 OFF（关闭）位置时，洗脱液会流入再循环阀。如果再循环阀也处于 OFF/WASTE （关闭/废液）位置，则洗脱液将通过废液口流入废液瓶。
如果再循环阀处于 ON/BOTTLE（打开/溶剂瓶）位置，则洗脱液将通过再循环口流回溶剂瓶。再循环阀可以手动设为 ON（打开）或 OFF（关闭）位置，或者可以启用“Automatic recycling after analysis（分析后自动循环）” 模式。在此模式中，每次分析完成后，再循环阀会自动切换到 ON（打开）位置，并在下一次分析开始前返回 OFF（关闭）位置。使用此模式的好处是可以实现溶剂连续流过检测器，不会出现溶剂使用过多或者流动相被循环样品化合物污染的情况。
如果吹扫阀处于ON（打开）位置，但洗脱液无法立即进入再循环阀，便会转而通过第二个换热器流到参比池，然后进入再循环阀。当只有流动相流过时，定期切换吹扫阀到ON（打开）位置可以确保参比池中的液体尽可能接近流动溶剂。吹扫阀可以手动设为打开位置，保持定义的一段时间，或者可以启用“Automatic purge（自动清洗）” 模式。在此模式中，每次分析开始前，吹扫阀会自动切换到 ON （打开）位置，保持定义的一段“purge time（清洗时间） ”。如果设了“purge time（清洗时间）”，则也必须设置“wait time（等待时间）”，以便让检测器基线在吹扫阀位置切换后稳定下来。
在清洗时间和等待时间都结束后，分析将开始。如果启用了“Automatic zero before analysis （分析前自动归零） ” 模式，检测器输出在分析开始前会立即归零。
这么一大堆内容，其实很多时候是不会进行溶剂回收的，还有就是，如果分析时间不是很长或者流动相组成稳定，个人认为在分析样品前平衡好参比池，在分析的过程中就没有必要再进行平衡。当然，持续的平衡是有好处的，因为这样做的话最大程度的降低了流动相的干扰。
示差折光检测器的性能优化
遵循下列十三点建议，优化示差折光检测器的性能。
1 正确放置溶剂和废液瓶
将溶剂和废液瓶放置在示差折光检测器和溶剂泵的上方。这样样品池中会保持一点压力，改善检测器的性能。
2 切勿使流通池超压
在增加另外的设备，如检测器或馏分收集器时，不要让石英流通池的压降超过5 bar。如果要安装额外的检测器，将其装到流路的上游，示差折光检测器的前面。
3 使用正确的溶剂
要尽可能减少基线噪音和漂移，溶剂级别必须为 LC 级，且使用前必须过滤。
4 做泄露检查
如果示差折光检测器所连接的 LC 仪器发生泄漏，就会造成基线长期噪音或漂移方面的问题。执行 Agilent 1200 系列压力诊断测试（针对泵和色谱柱之间的系统高压部件），确认仪器不存在泄漏。确保在线真空脱气机与泵的连接，以及检测器入口、废液口和再循环口的连接密封性良好。
5 验证过滤芯、滤光片和接头的质量
出现部分堵塞的过滤芯、滤光片和接头可能会造成基线长期噪音。验证所有类似部件中的压降是否都在预计的限度内。
6 控制光学设备温度
务必控制光学设备温度（加热器 = 开启），以保证最大的检测器敏感度；或者，如果样品池中的样品会在室内温度下沉淀，则将光学设备的升温设置为至少高于环境条件 5 °C。
7 设置适当的响应时间
在大多数的应用中适当的设定值是 4 秒。只有在高速分析时（使用高流速下的短柱），才建议使用小的设定值。要记住即使响应时间设置过高，快速峰会低一些、宽一些，但是保留时间和峰面积仍然是正确的、可复制的。
8 再循环流动相
使用再循环阀可以允许在没有分析运行的情况下自动再循环所输送的流动相。因此在进行下次分析前，泵流动可以不间断地持续进行，同时不会浪费流动相溶剂。另外，示差折光检测器必须处于稳定状态，保证可以随时投入使用。
9 考虑使用脱气机
对许多溶剂而言，使用脱气机可以达到更好的基线稳定效果。而对有些溶剂而言，脱气机可能无法带来更优质的基线。
10 冲洗脱气机
如果流动停止，而流动相仍滞留在在线真空脱气机中，则溶剂组成就会发生改变。因此，当再次开始流动或当使用新的流动相时，以泵的最大流速冲洗每个脱气机通道 10 分钟（打开泵的吹扫阀，避免 RI 检测器流通池中可能出现的超压现象）。
11 仅使用预混合的溶剂
切勿使用泵来混合溶剂。当一起运行 RI 检测器和四元泵时，绕过四元泵中的MCGV。实际上需要将四元泵转换为单元泵使用，方法是直接将从脱气机或溶剂瓶引出的溶剂进口管连接到泵的入口主动阀（使用接头，随附于检测器的附件工具箱中）。
12 考虑溶剂随时间出现的变化
特定溶剂随时间发生变化的倾向可能会造成基线漂移。例如，乙腈/ 水混合物中的乙腈成分会减少，四氢呋喃会形成过氧化物，吸湿性有机溶剂中的水含量会增加，参比池中的四氢呋喃等溶剂可能会重新气化。
13 消除流动相/色谱柱结合使用的问题
特定流动相与特定色谱柱结合使用时可能会生成长期基线噪音。例如，乙腈/水流动相与特定氨丙基键合固定相色谱柱。要消除流动相和色谱柱结合使用造成长期噪音的问题，使用毛细限流管取代色谱柱，并重新评估检测器性能。
Q：研究员做实验时，发现加热器坏了，系统噪音变大而且样品里有杂质分不开，研究员准备将等度洗脱换成梯度洗脱将杂质分开，是否可行？为什么加热器坏了，会导致基线噪音而且杂质分不开？
荧光检测器的英文全称是Fluorescence Detector，一般我们就直接称呼为FLD检测器。我们先来说说物质的荧光性。其实在自然界中能够产生荧光的物质是相对较少的，所以能够干扰荧光检测的物质也就相对来说就会少很多。那么没有荧光的物质就没办法使用荧光检测器了？当然不是了，我们可以通过化学反应将不能产生荧光的物质变成可以产生荧光的物质，就可以利用荧光检测器来进行检测了。聪明的你是不是有了如下疑问：既然荧光可以产生是不是也会被猝灭？你真聪明！！！当然了，荧光也是会被猝灭的，所以我们要保护好我们的样品，防止其被猝灭而影响检测。这就要求我们使用的溶剂本省不能猝灭样品的荧光，而且要求溶剂里不能溶解氧气，因为氧气也会引起荧光的猝灭效应，所以溶剂在使用时一定要做脱气处理。
那么荧光是如何产生的呢？
发光是指激发态分子从激发态回到基态时发生的发光现象。分子可被不同形式的能量激发，每种都有其各自的激发过程。例如激发能是光时，这一过程叫做光致发光。
光致发光是荧光和磷光这两个现象的集合名称，两者的特性差异在于分子被激发后的发光延迟的不同。如果分子被照射之后发光时间为10-9秒到10-5秒，这一过程叫做荧光。如果分子被照射之后发光时间大于 10-3秒，则这一过程叫做磷光。
基本来说，基态的分子吸收能量变成激发态，激发态的分子释放能量变回基态，光的发射是吸收的反过程。例如钠的蒸气，其激发和发射光谱在相同的波长下为一条单一的线。而有机化合物溶液的激发和发射光谱不是线光谱，而是带光谱。
图八：吸收 vs. 发光
想要发出荧光就需要先被光照射，当入射光激发样品的分子时，样品就发出散射光，即产生 Raman 效应。多数这种散射光和入射光具有相同的波长，但也有一些散射光具有不同的波长。这种非弹性的散射光叫做 Raman 散射。这是由于分子改变了它的光子运动。
入射光(Ei)和Raman散射光(Es)之间的能量之差等于改变分子振动状态（即让分子产生振动，Ev）的能量。这一能量之差叫做 Raman 位移。
Ev = Ei - Es
常常可以观察到多种不同的Raman位移，每一Raman位移都伴随着样品中分子的振动和转动。特定的分子及其环境决定着出现何种Raman信号（如果有的话）。
Raman 强度对 Raman 位移的函数曲线就是 Raman 光谱。
光学系统的元件包括氙闪光灯、激发聚光镜、激发狭缝、反光镜、激发光栅、流通池、发射聚光镜、截止滤光片、发射狭缝、发射光栅和光电倍增管都装在检测器室中的一个金属盒子里。荧光检测器的光栅/光栅光学元件，可以同时选择激发和发射波长。可以从荧光监测器的前面进入流通池。
图十：荧光检测器原理图
光路有点复杂，我们就只讲讲光源吧!光源是一个氙闪光灯，灯以3μs的闪烁频率发出200 nm到900 nm的连续光谱。光输出分布可以用间隔为100nm 的百分比来表示。此灯可以使用约 1000小时，具体取决于灵敏度要求。如果灯的闪光是单波长而且功率高，那么荧光的数据速率是 296 Hz。这意味着样品每秒钟被照亮 296 次，由已从色谱柱中洗脱的各种组份产生的所有亮光每秒钟被检测 296 次。
前文提到，激发后的可以发光的物质的发光时间很短，荧光发光时间为10-9到10-5秒，磷光发光时间,大于10-3秒，这两种光的发光时间都很短，但是荧光和磷光之间也差了至少另个数量级。所以，如果进行荧光检测时，当灯闪光时，样品中有荧光的物质几乎会立刻发出荧光。荧光的寿命很短，所以荧光监测器仅可以在灯照射之后的很短时间内进行测定如果进行磷光检测时，当灯闪光时，磷光的寿命短（比荧光长），所以监测器测定的时间可以在灯照射之后晚于荧光的时间内进行测定。
所以说，荧光检测器不一定只能测定荧光还可以测定磷光，所以它可以叫发光检测器。
本想一次性将剩下的几种检测器都讲完的，结果发现内容还有点多，今天就讲了两种检测器，还有三种检测器：蒸发光散色检测器（ELSD）、电喷雾检测器（CAD）、电化学检测器（ECD），我们下次再讲！！！
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