诺奖得主凯林的“十诫”：做实验的时间和论文数量是线性相关的
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昨日，2019年诺贝尔生理学或医学奖颁发给了哈佛医学院的小威廉·凯林（William Kaelin. Jr）、牛津大学的彼得·拉特克利夫爵士（Peter J. Ratcliffe）和约翰霍普金斯大学的格雷格·塞门扎（Gregg L. Semenza）（图1） 。三位科学家因发现动物细胞如何适应氧气张力的变化（"for their discoverys of how cells sense and adapt to oxygen availability"）而受到表彰。
曾经与诺奖得主小威廉·凯林在Dana-Farber癌症研究所共事的Wenhua Gao为我们分享了凯林实验室的独门“十诫”。
这份“十诫”有两个版本。2005年的第一版中，一些条目出自凯林当年做博士后时的导师大卫·利文斯顿（David Livingston），科学家们优秀的治学作风一脉相承。“十诫”的头一条这样写道：”When I was a post-doc in David's lab…（当我还是大卫实验室的一名博士后时……）”，传递出凯林与导师的深切感情和他对漫漫科研长路的回味。
新版“十诫”自2017年推出，字里行间不乏“老学究”的小调皮，比如下面这条：
”Trust me on this, I have been doing this for __ years!” *Fill in blank by taking current years and subtracting from 1992.
“这事你信我就对了，我已经在这方面做了__年了！” *空白处填上当前年份减去1992年。（意思是凯林从1992年起就开始从事该领域研究。）
10. “There are two types of scientists. One whose worst nightmare is to be second, the other whose worst nightmare is being wrong. You have to decide which kind you want to be.”
9. “There is an almost linear correlation between hours at the bench and number of papers.”
8.“Unless proven otherwise, all loss of fitness phenotypes are off-target”
7. “What you have here is an analog result, but what you want is a digital result”
6.“Where is the rescue?”
5. “Robustness and reproducibility are NOT the same thing”
4.“What is the most trivial explanation for these data?”
3.“The experiment is only as strong as your controls”, sometimes phrased as “Nothing is sadder than a blank blot”
2.“Trust me on this, I have been doing this for__years!”
· Fill in a blank by taking current year and subtracting from 1992.
1.“The honeymoon is over”
·· Hint: the honeymoon lasts a year
凯林通过这样的形式传达对博士后团队的谆谆教诲。“Where is your rescue?”凯林问道。Wenhua介绍说，做RNA干扰(RNAi)或者是CRISPR 敲除实验时，出现表型(phenotype)后应该把原基因再表达回去，看看该表型是否可以逆转，这叫作“挽救实验（rescue experiment）”，其目的是为了去掉脱靶的可能性。尤其是在RNAi后，如果看到对细胞生存的负面效应，必须做挽救实验，以确保该现象不是脱靶效应导致的。
其他的条目也很有意思，欢迎大家讨论讨论每一条的含义~
低氧研究正当时
诺贝尔生理学或医学奖授予的是能带来“人类最大福祉”的科学发现，那么今年获奖的这一发现对人类健康的直观意义何在？未来发展前景又如何？
带着这些疑问，我们和美国德克萨斯大学西南医学研究中心（UT Southwestern Medical Center）的张青教授进行了对话。张教授长期从事细胞低氧反应研究，在2006至2011年间，曾在今年诺奖得主之一凯林的实验室工作。
张教授介绍，氧感知是一个普遍存在的现象，在癌症中亦是如此。HIF抑制剂对于癌症治疗意义重大，目前正有HIF-2α抑制剂治疗肾癌的临床试验，而HIF-1α抑制剂的开发仍很有挑战性。同时，氧感知通路的研究既包括依赖HIF的信号通路，也包括与HIF无关的信号通路。例如，HIF-2α抑制剂仅对50%的肾癌患者有效。因此，研究多种信号通路对于开发新的单独或联合使用的治疗方法都具有重要意义。
尽管至今仍然没有直接抑制HIF的药物被批准用于癌症治疗，不过，去年一种HIF-PH（脯氨酸羟化酶）抑制剂新药罗沙司他(Roxadustat)在中国率先获批上市，用于治疗因慢性肾脏病 (CKD) 引起的贫血。据估计，中国的CKD患者已过亿，2017年血液透析患者保守估计在50万人以上，且呈快速增长趋势。罗沙司他胶囊的上市为因CKD引起贫血的国内患者带来了新的治疗希望。张教授说道，这一药物的研发可以说是诺奖研究成果带来的一项直接结果。
除了在治疗贫血方面的成效，脯氨酸羟化酶抑制剂未来可能会在炎症性肠病等方面产生更广阔的临床应用，许多相关临床试验也正在进行中。
从与张教授的对话中我们了解到，以HIF为核心的细胞低氧适应研究在贫血方面的应用价值苗头初显，而在癌症等临床领域内的研究更是方兴未艾。经诺奖进一步加持，可以预见HIF相关的研究会进一步吸引研究者的目光。
详解氧感知通路
18世纪末，瑞典药剂师卡尔·舍勒（Carl Scheele）认定，大约四分之一的空气是“火气”，即大气中可以让物质燃烧的成分。与此同时，英国的神学家和哲学家约瑟夫·普利斯特里（Joseph Priestley）发现了一个提纯这种气体的方法。在一次与普利斯特里的偶遇后，法国贵族、政治家、科学家安托万·拉瓦锡（Antoine Lavoisier）成功地复制了普利斯特的提纯方法，并将提纯到的物质命名为“氧”。后来，普利斯特里和拉瓦锡亲眼目睹他们的实验室被暴徒摧毁；拉瓦锡不久就被处死了，而普利斯特里逃到了美国。尽管他们的实验室被烧毁，但 “氧”这种其气体作为生命的燃料依旧立于生命研究的中心地带。
虽然氧气是细胞呼吸的必要因素，但从贝尚（Bechamp）和巴斯德（Pasteur）开始，人们就知道细胞呼吸过程其实是更复杂的氧平衡的一部分：动物可以利用多种途径来完成能量生产，包括在必要时转换到厌氧发酵。到上个世纪中叶，这种多方位的适应能力已经成为生化知识领域中的一条常识。但是，在三位科学家做出他们的贡献之前，这种适应性在基因表达水平上如何被调控，人们还完全不清楚。
众所周知，许多对氧气水平的生理和代谢反应都是转录层面的。信使RNA（mRNA）编码了许多糖酵解酶[1，2]、血管生成因子（VEGF）[3]和促红细胞生成素[4]等一系列蛋白；当细胞中的氧气水平下降时，受低氧条件刺激，编码上述这些蛋白的mRNA含量就会升高，让机体适应低氧环境。例如，促红细胞生成素升高，机体生成更多的红细胞，携带更多的氧，以满足机体的需要。
人们在基因中分离出一些专门响应氧气水平的序列，称为HRE（hypoxia-responsive element），或低氧反应元件[5]。赛门扎和拉特克利夫的团队都积极地参与这些调控序列的鉴定，寻找结合低氧反应元件的因子。在这场竞赛中，塞门扎的研究小组率先克隆了一个转录因子，称之为HIF（hypoxia-inducible factor），意为低氧诱导因子[6]。
后续的研究逐步发现，在很多氧气调节的基因中都存在低氧反应元件，而低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）可以直接调控数百种mRNA的表达。通过HIF作用改变基因表达，几乎影响了细胞生理和代谢的方方面面，这对动物细胞适应体内和环境中不断变化的氧气水平至关重要。
早期的研究表明，有机体的发育和体内稳态维持在许多方面都依赖于HIF的作用；同时，癌症、炎症、组织损伤和愈合等机体面临的诸多挑战也都与HIF的应答有关。这方面的工作进展迅速，实验反复表明，从免疫反应、心血管功能一直到神经控制，HIF介导的氧化反应在整个生物学领域中都很重要。也正因如此，当人们后来又发现HIF参与大量疾病发生发展过程时，没人觉得惊讶了。
赛门扎发现，HIF是一个由两个碱性螺旋-环-螺旋家族因子组成的DNA结合二聚体。这个二聚体的一部分是HIF-1α；另一部分最先被称为HIF-1β，后来才发现它正是之前就被克隆出来的芳烃受体核转运蛋白。由于HIF-1β对氧气水平并不敏感，人们认识到一个重要事实——对氧气敏感的HIF-1α才是细胞响应低氧条件的关键。
那么，问题来了，HIF-1α又受谁的调控呢？不同于往常研究的是信号转导之类的事件，这个问题的答案必须落实到对氧气水平的直接反应——即氧气本身的水平。凯林和他的合作者发现，肿瘤抑制因子VHL（与von Hippel-Lindau家族性癌症相关）的突变会导致HIF调节基因的表达增加[7]。随后，拉特克利夫团队又发现，在缺乏VHL的细胞中，HIF-1α对氧气改变所产生的变化消失了[8]。考虑到VHL参与泛素化和蛋白质更替，这个发现为HIF-1α的调控提供了一个潜在的机制。
这之后最关键的研究，就是拉特克利夫和凯林团队发现HIF-1α蛋白中的脯氨酸残基被羟基化——这个羟基化修饰对于VHL复合物的结合至关重要[9，10]。随后，拉特克利夫团队，以及Bruick和McKnight分别发现了催化这种修饰的候选脯氨酰羟化酶（PHD）[11，12]。鉴于脯氨酸羟化作用需要分子氧的参与，这就在理论上建立了一个细胞在翻译后水平调节HIF的模型（图2）：
随着氧气水平的降低，HIF的羟化作用减少，从而导致VHL复合物的结合减弱，泛素化程度降低，HIF-1α的蛋白酶体降解作用减弱，最终，HIF-1α（及其异构体HIF-2α[13-15]）在缺氧状态下积累，从而诱导基因表达，帮助细胞调整在低氧水平下的生存方式。赛门扎之后发现了一种HIF抑制剂——FIH[16]，为这个模型又增加了一个微妙之处。FIH也是一个羟化酶，虽然它在HIF-1α蛋白的不同区域通过改变通路的转录激活而不是调节HIF蛋白质转换起作用，但是其活性改变也是受氧气介导的[17]。
许多研究团队的工作已经证明，HIF的氧感知通路坚实可靠，在调节氧气影响的基因表达中起关键作用。在HIF的发现过程中，这三位研究人员凭其发现是当之无愧的核心人物，引领着这项工作的进程。他们不仅积极参与对HIF调节的分子生物学过程的逐步阐释，而且帮助我们更深地理解了低氧反应在健康和疾病中所起的生理作用。
调节HIF- 1α稳定性的脯氨酸羟化酶的发现，使人们能够寻找抑制剂，这为药理学研究开辟了新的途径。事实上，多个影响HIF功能的潜在药物已经在临床试验中取得了很大进展。目前的临床研究主要集中在对于贫血的治疗上，这使工作回到其最初的目标之一，即操纵促红细胞生成素的表达。但考虑到HIF影响的疾病范围，今后肯定会有更多的临床应用出现。
参考文献
[1] Firth JD, Ebert BL, Pugh CW, Ratcliffe PJ (1994) Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: Similarities with the erythropoietin 3′ enhancer. Proc Natl Acad Sci USA 91(14):6496–6500.[2] Semenza GL, Roth PH, Fang HM, Wang GL (1994) Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia- inducible factor 1. J Biol Chem 269(38):23757–23763.[3] Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E (1992) Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 359(6398):843–845.[4] Schuster SJ, Wilson JH, Erslev AJ, Caro J (1987) Physiologic regulation and tissue localization of renal erythropoietin messenger RNA.Blood 70(1):316–318.[5] Semenza GL (1994) Regulation of erythropoietin production. New insights into molecular mechanisms of oxygen homeostasis.Hematol Oncol Clin North Am 8(5):863–884.[6] Wang GL, Semenza GL (1995) Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 270(3):1230–1237.[7] Iliopoulos O, Levy AP, Jiang C, Kaelin WG, Jr, Goldberg MA (1996) Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein. Proc Natl Acad Sci USA 93(20):10595–10599.[8] Maxwell PH, et al. (1999) The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399(6733):271–275.[9] Ivan M, et al. (2001) HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing. Science 292(5516):464–468.[10] Jaakkola P, et al. (2001) Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 292(5516):468–472.[11] Epstein AC, et al. (2001) C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 107(1):43–54.[12] Bruick RK, McKnight SL (2001) A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science 294(5545):1337–1340.[13] Tian H, McKnight SL, Russell DW (1997) Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev 11(1):72–82.[14] Hogenesch JB, et al. (1997) Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-PAS superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway. J Biol Chem 272(13):8581–8593.[15] Ema M, et al. (1997) A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1alpha regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development. Proc Natl Acad Sci USA 94(9):4273–4278.[16] Mahon PC, Hirota K, Semenza GL (2001) FIH-1: A novel protein that interacts with HIF-1alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev 15(20):2675–2686.[17] Lando D, et al. (2002) FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Genes Dev 16(12):1466–1471.特 别 提 示
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