【细节决定成败】让一例丑陋不堪的组织切片H&E染色变美的探索历程
组织切片是患者组织研究和动物实验最基本的技术手段，但切出可以进一步实验的组织并不是轻松的事情，里面有很多细节。
作者：
王孝养 博士
及组织病理、细胞和动物模型群友
遇到问题
常规的组织切片通常是将石碏组织块放在冰水上浸泡十几分钟，然后再用Microtome进行切片，切片的厚度通常是4至5微米。下图是一例乳腺癌的组织，从这张图看得出来：片子细胞凹凸不平，尤其是细胞核成条状排练。这样的片子不论是用于临床诊断，还是科研用，肯定是拿不出手的。由于组织处理和石碏包埋不是我们做的，其操作详情不得而知。
有据假设，小心验证
我们推测是否是刀片变钝了，于是我们使出第一招 ：
将切片机的一次性刀片换成了全新的，在切片的时候尽量均匀而又快速，希望能切出平平展展的组织。
我们在热水摊片仪里摊片的时候也尽量摊的时间长一些，希望让片上的皱褶展平，但最后的结果还是不尽如人意，凹凸不平的情况并没有明显的改善。
我们推测可能组织太硬，所以需要软化一下，于是我们使出了第二招：
让组织块在冰水中泡长一些时间，我们泡了一个小时以后再切片。
遗憾的是，这一招也不灵。
最后，我们使出了第三招，还是希望石蜡组织能够软化，这样切起来就不会太脆。
我们的方法是，将石蜡块放在37到38摄氏度的温水中，浸泡半个小时，然后再转到冰水中放置个1到2分钟后，立即切片，结果片子切得非常漂亮，成功了！
看看这张片子，以前的细胞核象3D丝粒体状的结构是否是消失了？
胞浆和胞核的形态结构恢复了本来的应有的面目。
知所以然
做学问喜欢问个究竟，为什么开始的组织切片会成这样呢？原因不外乎两个：
第一，组织处理脱水不干净，
第二组织处理脱水过度，脱得太干了。
如果是第一种情况，石碏块泡在水中会发胀发白，这块组织没有这种现象。所以我们的结论是：这个组织标本的脱水过度了——太干了。
解决方案：
在组织处理时，组织在100%纯酒精里标本停留时间不能过长，根据组织大小，一般两到三个小时即可，如果是小标本可以更短一些。另外一个办法就是在纯酒精里面混合甲醇和异丙醇，这样就不会脱水太干。一旦出现脱水过度，先用温水浸泡半小时到一小时，再用冰水泡几分钟，即可切出漂亮的组织切片。
希望我的经验对感兴趣的同行有用。
群友讨论
群友 A：
这种overprocess情况，我一般是用三盆水解决：漂片水浴四十二三度放置十至十五秒，室温水三十秒，冰水三十秒即可切出三五张好片子。
如果切出来的组织部分基本透明说明水化充分，如果发白就需要再如上处理一轮。根据组织类型不同可以适当调节时间。
群友B：
组织太干也经常发生！现在都用机器自动处理，很多实验室不同组织就用一个protocol，导致不同组织脱水程度不同。
曾经切过骨骼肌组织，完全切不出片子，切到组织处就粉碎了，怎么切都不行一气之下扔那不管了，在冰水里泡了一天，再看时组织都鼓出来了，结果倒是切出好片子了，意外收获。
群友C：
在组织病理中心实验室通常不会按组织大小分开process。所以组织处理程序设计要以较大组织为标准设计时间和温度。
稍小的经过这种处理后肯定是over process。还好可以用“冰火两重天”这招来补救。
用冰水处理这一步我习惯把它叫rehydrate。这一步的关键是根据经验，不同的组织用不同的时间。千万不要over rehydrate，后果就是组织胀大，突出表面，切片后，过几天组织干了以后又收缩，表面出一坑，为将来重复切片带来困难。
还有就是包埋机冷台温度过低，冷却太快导致的组织与石蜡冷却凝固不同步。有时也可以表现为凝固的蜡快有裂隙。
冷台温度过低如果没办法调温的话，可以在冷台上加一层tissue paper再放包埋的molds，延迟一下会好很多。
我training技术员石蜡包埋技术时最长和他们说的就是石蜡；是技术员如何操控石蜡和组织温度，做到可控条件下让组织和石蜡凝固合为一体。
如果有很多都没处理好的话，最好倒回去重新用比较长的程序再处理一次。如果仅仅是浸蜡不够的话可以用融掉后，用真空烘箱再浸蜡一到两个小时即可。这种真空烘箱也适用于气孔较多的组织，可以保证让组织里的气泡全都消除，被石蜡取代。
群友D：
细节决定成败。
作者：王孝养 博士；本期编辑：Daniel。
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