吸入制剂体内外相关性评价模型的概述
吸入制剂体内外相关性评价模型的概述
An Overview on Evaluation Models with in vivo-in vitro Correlations for Inhalation Products
来源
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2019, 50(1)
作者
胡 玥，盛云华，唐黎明，陈 刚，陈桂良
上海市食品药品检验所
复旦大学药学院
中国医药工业研究总院
上海药品审评核查中心
摘要
吸入制剂体内外相关性研究，是通过建立体外模型预测药物在体内的作用特征，指导和优化处方设计，调整制剂工艺，评估药效和安全性，从而提高研发效率，节约研发成本。
本文总结了吸入制剂体内外相关性研究中常用的体外模型，包括用于预测药物肺部沉积的呼吸道物理模型，预测药物体内药代动力学的计算机模型，以及预测药物安全性和体内过程的体外细胞和3D 器官模型，并探讨不同模型的应用范围、优势和局限性。
正 文
吸入制剂主要用于哮喘和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 的治疗，近年来还应用于治疗肺部感染、肺部囊性纤维化和呼吸道肿瘤等，同时也用于糖尿病等全身性疾病，应用十分广泛[1]。
与传统剂型不同，大多数吸入制剂主要对呼吸道和肺部产生局部作用，其药效不依赖于全身循环吸收。
由于局部药物浓度与血液和尿液中的药物浓度缺乏相关性，建立能够有效预测肺部药物沉积和体内过程的体内外相关性模型是一项艰巨的挑战。
此外，大多数吸入制剂产品复杂，处方和装置的结合增加了生物等效性(bioequivalence，BE) 建立的复杂性。
体内外相关性( in vivo-in vitro correlation，IVIVC) 指的是用于描述某一药物的体外特征与体内反应间相关关系的一种预测性数学模型[2]。
吸入制剂体内外相关性研究的主要目的是通过药物体外特性预测其在体内的作用特征；建立体内外相关性能更好地表征产品性能，反映肺部沉积和临床效果，其意义在于指导和优化处方的设计、确立更具代表性的试验方案、合理调整制剂和工艺以及用于生物等效豁免，节约开展临床试验所需的时间和费用。
药效和毒性的体内外相关性模型可为药物剂量设计和风险评估提供参考依据。建立可靠的体内外相关性评价模型能够缩短药物研发周期，降低研发成本[3]。
本文总结了吸入制剂体内外评价研究中常用的模型，包括用于预测肺部沉积的模型、预测体内药代动力学的计算机模型以及预测安全性和有效性的体外细胞/ 离体组织模型，并探讨不同模型的应用范围、优势和局限性。
1
预测药物肺部沉积的模型
喉部沉积是药物肺部沉积变异度的主要来源。
然而，用于测定空气动力学粒径的美国药典人工喉过于简单，无法充分模拟呼吸道的几何形状和实际使用时的呼吸模式。
该模型主要用于产品的质量控制，在预测体内药物沉积方面十分局限。
利用各种影像技术获得呼吸道的立体构造，构建呼吸道物理模型可以更加准确地预测肺部沉积。通过在体外测定药物沉积，建立拟合曲线得到预测结果，可以与体内沉积数据进行比较。
尽管一些案例中体外和计算机的方法能够预测体内沉积，但使用成像技术和模型无法获得所有呼吸道中的流体和气溶胶力学的细节特征，气溶胶在装置和呼吸道中高度复杂的行为也对计算机方法提出了更高的要求，因此仍存在一些局限性[3]。
美国FDA 也表示，尽管对于用体外方法证明吸入制剂仿制药的生物等效性有了前瞻性的研究，但仍需要仿制药企业采用包括体外方法证明BE 的研究、药代动力学为终点的BE 研究、比较临床终点BE 研究以及证明处方和器械相同性的研究，这4 个因素的证据权重(weight-of-evidence)方法证明生物等效性。
1.1 利用影像技术构建仿真呼吸道物理模型
利用3D 计算机断层扫描(computerized tomography，CT) 和核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI) 成像，可获得呼吸道和肺部的高分辨3D 图像，尤其是MRI 能够区分软组织和呼吸道本身之间的界面，进而建立物理模型[4]。
尽管多层扫描能够显著提高CT 的分辨率，但对人体的放射性剂量过高，限制了CT 在气管、支气管模型上的应用[5]。
此外，口咽部的角度随着头部的倾斜而改变，喉部的形态还与性别、年龄和气流速度有关，气管支气管和肺部的大小以及棱状突起的形态随着呼吸不断变化，因此很难预测和模拟患者实际使用吸入制剂的模式[6]。
近年来，动态MRI 具有较高的时间分辨率，触发核磁共振成像(triggered MRI)能够呈现口咽部和上呼吸道详细的3D 图像，其图像的改变代表药物沉积模式的改变[7—9]。
呼吸道物理模型需要在内表面涂覆一层黏性液体( 如硅油、甘油等)，避免粒子沉积后再飞散。结合活体3D 成像得到的口腔- 咽喉的物理模型与呼吸模式，用于IVIVC 造模预测总肺沉积( total lung deposition，TLD)，能获得准确的预测结果[10]。
2016 年美国FDA 向弗吉尼亚联邦大学拨款，用于研发替代吸入制剂体内BE 研究的体外模型。
Byron等证明经几何参数优化的口腔和咽喉模型可以用于估算总肺沉积，但仍存在一些局限性，有待进一步研究[3]。
1.2 计算机流体动力学(computational fluid dynamics，CFD) 模型
CFD 模型能够预测药物在呼吸道的局部沉积，进而测试并优化吸入制剂产品。研究者一般通过以下3 种方式建立物理模型：
①文献中的几何学参数；
②分析影像学数据得到代表性几何学参数；
③整合医学影像和空气动力学参数得到理想化的几何学参数。
多数情况下，简化几何学参数能使模型更容易被制造和应用[11—13]。
然而由于呼吸道结构、流体动力学和气溶胶理化性质的复杂性，精确模拟呼吸道十分困难。
Koullapis 等根据人体真实的呼吸道结构建立了体外仿真模型和用于沉积测试的物理模型，包含口腔、喉部、气管支气管等结构[14]。
同时应用3 种不同的大涡模拟(large eddy simulation，LES) 模型和3 种RANS(Reynolds Averaged Navier Stokes) 模型模拟呼吸道气流和不同粒径大小颗粒的沉积模式。
对于较大的颗粒，LES 模型预测局部沉积获得了较好的结果，RANS 模型对于较小和中等大小的颗粒的沉积预测过度，而对于较大的颗粒沉积则预测不足。因此筛孔大小和颗粒轨迹对沉积有较大影响[10,14—15]。
1.3 改良撞击器模型
患者的呼吸模式对气溶胶的形成和沉积模式具有显著影响，在固定气流下进行测试主要用于产品质量控制[16]。
在患者的实际使用过程中，流速是随着时间而变化的。因此，IVIVC 需要考虑不同呼吸模式的影响，将用口腔、咽喉、上呼吸道模型得到的与撞击器得到的空气动力学粒度分布 (aerodynamic particle size distribution，APSD) 数据结合，预测肺部沉积。
Thiel 等采用Stahlhofen 模型，通过分析不同吸入制剂( 沙丁胺醇气雾剂、特布他林粉雾剂等)的空气动力学粒度分布数据预测TLD，并提出在预测肺泡沉积时气溶胶在肺部的滞留时间需加入呼吸控制校正[17]。
与此同时，在线Aerosol Research Laboratory at Alberta(ARLA) 呼吸道计算器，采用无量纲参数获得个体间的几何学差异，可以获得与Thiel 等报道相近的预测结果。
Stahlhofen 方程采用APSD 数据预测吸入制剂在肺部和气管支气管的沉积，其预测的不确定性在于吸入制剂通常是不稳定的多分散体系[16]。
Finlay 等采用吸湿性人体肺部沉积模型(hygroscopic human lung deposition model) 将不稳定且易吸湿的气溶胶在气管支气管和肺泡的局部沉积预测结果与单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography，SPECT) 数据进行对比，同时预测不同人群的沉积变化情况，获得了良好的验证结果[18]。
为了准确预测气溶胶在口咽部的沉积以及离开口咽部进入气管的气溶胶特征，还需要考虑热能、质量、物态变化( 液滴与气态相互转化)。这类模型的研究和验证有待深入进行。
2
预测体内药代动力学的计算机模型
吸入制剂的疗效在较大程度上取决于药物、制剂、装置、患者各个因素之间的复杂的相互作用。
在传统的新药研发过程中需要对候选药物开展一系列临床前和早期临床试验，若药代动力学特征或治疗窗不合适就可能会被终止。
仅仅依赖实验方法会延长研发周期，同时提高研发成本[19]。
利用计算机模型如生理药动学(physiological based pharmacokinetic model，PBPK) 模型，可以预测药物在体内局部或全身的吸收、分布、代谢、排泄 (absorption, distribution, metabolism and elimination，ADME)，充分理解药物递送系统、药物分子与肺部的相互作用，在治疗的程度和时间以及全身性的不良反应之间找到合适的平衡点。
PBPK 模型可通过一系列的步骤预测药物在肺部的行为。需要充分了解以下多个环节之间的关系：
①药物在肺部沉积的量；
②沉积的药物粒子的溶解度；
③溶解的药物通过肺黏液层进入细胞内的扩散速率；
④渗透进入和穿过细胞进入体循环的药量，以及上述参数与沉积部位之间的关系[20]。
然而，目前无法对上述所有的过程进行量化，这方面的研究尚在初始阶段。
目前商品化的软件仅有GastroPlusTM和Simcyp SimulatorTM ，还有一些实验室内部开发的软件[21]。
计算机模型的发展能够帮助筛选吸入制剂药物、制剂、装置的组合，用试验数据进行描述，并用模型将试验数据和过程机制进行整合，找到决定局部和整体暴露的关键性过程。
2.1 GastroPlusTM ADRM
GastroPlusTM ADRM(GastroPlusTM 鼻腔- 肺部房室吸收转运模型，美国Simulations Plus 公司) 是目前唯一将PBPK 模型与肺部沉积、溶出度、肺部清除等数据结合的商品化计算机模型。
该程序包含肺部3 个主要部分( 分别为大、小气管和肺泡间隙，即BB、bb 和AI) 以及胸腔外部分(ET)。
各部分又进一步分为呼吸道黏液部分和上皮/ 肺组织部分。用户可以对每个部分设置相关的生理学参数，定义沉积模式，与其他类似的沉积模型( 如ARLA和Mimetikos 模型) 兼容[21]。
该软件应用Noyes-Whitney 原理，基于粒度分布、溶解度和扩散速率的数据模拟溶出过程；运用一级黏膜纤毛转运模型模拟药物由气管上行进入胸腔外，而后进入胃肠道的过程[22]。溶出的药物从呼吸道黏液进入肺组织的方式分为被动扩散和主动转运。
根据药物的相对分子质量和呼吸道不同部位的上皮厚度估算肺泡间隙的渗透性。
两种动力学清除过程与溶出模型结合，能够模拟沉积模式和溶出度对肺部生物利用度和吸收速率的影响[23]。
药物经肺组织吸收进入体循环主要受到组织血流量以及血液与组织间的分配系数的影响，这些参数可以通过实验或采用标准化的PBPK 模型进行计算。
2.2 Simcyp SimulatorTM 和PK-SIMTM
Simcyp SimulatorTM 和PK-SIMTM 利用肺部和胃肠道吸收的试验数据对药动学(PK) 进行建模。
Gauhua 等应用Simcyp 研究抗结核药物在肺部和全身的药代动力学[24]。
Stass 等运用PK-SIMTM 将健康受试者吸入环丙沙星后的PK 数据去卷积，得到口部、气管支气管以及肺泡间隙沉积的药物分别对全身暴露的作用[25]。
这些PBPK 模型在预测药物在临床前和早期临床的药动学时，将溶出度和上皮渗透率简化为一级速率反应，而没有考虑药物实际在肺部的复杂过程，以及肺的不同部位吸收和非吸收两种清除模式之间的平衡，从而限制了模型的应用。
2.3 实验室内部模型
除了商品化的软件程序，还有许多实验室内部定制的肺部吸收模型用于吸入制剂的研发。
Boger等预测了难溶性吸入药物丙酸氟替卡松在大鼠体内的行为[26]。
在吸入和静脉给予大鼠丙酸氟替卡松后，测定了肺部糖皮质激素受体被占据的时间过程。
通过模型可以预测吸入和静脉给药后丙酸氟替卡松的药代动力学和受体占有率。
该研究表明，在肺部灌注良好的部位难以实现肺部的选择性，药物与受体的缓慢解离对于肺部选择性具有关键性作用。
Merck 公司开发的一种计算机模型整合了肺分级沉积模型、溶出度模型、气管支气管模型、吸收模型、药效(PD) 模型、以及PBPK 模型。
采用给予大鼠和志愿者糠酸莫米松、布地奈德、沙丁胺醇和福莫特罗后的PK 数据对该模型进行了验证。
结果提示该模型可提供有价值的肺部选择性( 肺部和全身浓度的比值) 信息[26]。
Bhagwat 等采用两种方法，运用空气动力学粒度分布和溶解性数据预测吸入性糖皮质激素(inhaled corticosteroids，ICSs，包括糠酸莫米松、布地奈德、丙酸氟替卡松) 干粉吸入剂的全身药代动力学。
两种方法均从级联撞击器试验结果得到总肺剂量和肺沉积率，但得到肺部吸收速率的方法不同。
方法一根据体外空气动力学粒度分布和体外药物溶解度预测体内药物溶出和吸收速率。
方法二通过体外Transwell 溶出试验计算平均溶出时间(MDT)，从而得到一级吸收速率。
两种方法的预测结果与文献报道的药代动力学特征相一致。方法一采用更加复杂的策略来预测溶出吸收过程，但在预测的准确性方面与方法二相比并没有明显的优势[20]。
Eriksson 等采用大鼠离体肺灌注模型得到10 个吸入制剂的转运数据，导入计算机模型估算肺部渗透率和组织滞留；并与Caco-2 细胞模型获得的渗透性数据进行相关性研究。
结果显示该计算机模型能较好地描述药物在肺部的转运特征[27]。
3
预测吸入制剂的安全性和体内过程的体外模型
预测吸入制剂的安全性和体内过程的体外模型出于降低实验成本和医学伦理方面的考虑，体外模型日益受到关注。
体外模型产生的数据能够在某些方面预测药物对人体的反应，如安全性、体内过程、生物利用度等[28]。
不同模型的组合可以得到体内外相关性更好的数据，提升初筛的效率。
简单的模型能够获得重复性更好的数据，但同时无法反映不同类型细胞间的相互作用。
3.1 体外细胞暴露模型
体外细胞培养有浸入式的单种细胞培养和多种细胞共培养体系，也有人呼吸道细胞的气液界面培养(air-liquid interface，ALI)。
在浸入式培养中，培养基能够维持正常上皮细胞的表型、基因的表达，但同时也阻碍气体的扩散[29]。
气液界面培养能够使气体直接接触所培养的呼吸道细胞，使研究更加接近气体在人体内的作用方式。
共培养模型整合了胚胎干细胞[ 来源于肿瘤的细胞株( 如NIH-292 细胞)、永生化细胞株( 如BESA-2B 细胞) 以及原代细胞( 如NHBE 细胞) 等]。
气- 液界面暴露系统能够模拟气溶胶在呼吸道的沉积过程，避免细胞培养液对气溶胶暴露的干扰，使气溶胶与细胞表面直接接触，达到最大程度的暴露，适用于评估气态、液态和固态气溶胶。
暴露系统颗粒沉降的机制包括扩散、沉降、云沉降、静电沉淀等。
细胞体外暴露试验常用的暴露系统有Cultex 和VitroCell[30—31]，以及干粉气溶胶沉降过程研究采用的PADDOCC(pharmaceutical deposition device on cell cultures，暂译为细胞培养药物沉积装置)[31]。
有研究者分别采用体内和体外的方法研究化合物和纳米粒子导致的吸入毒性，根据美国环境保护局(Enviromental Protection Agency，EPA) 和全球化学品统一分类和标签制度(Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals，GHS) 的标准分级，对比研究得到的IC50 值与大鼠的半数致死浓度LC50 值，发现一些化合物在采用肺切片、细胞单层以及商品化的共培养模型预测有无毒性方面具有良好的专属性和灵敏度[32—33]。
2016 年“Alternative Approaches for Acute Inhalation Toxicity Testing to Address Global Regulatory and Non-Regulatory Data Requirements”研讨会中，对急性吸入毒性替代试验的要求以及努力实现非动物试验方法获得全球监管机构认可的事宜进行了深入讨论。
虽然在多数情况下许多监管机构仍需要体内试验数据，但非动物实验方法可以作为验证和优化的手段。非动物模型的简化和标准化将有助于提高监管机构的接受度。
政府、工业界、学术界和非政府组织需要共同努力，推进非动物方法的实施和全球监管机构的接受度[34]。
除了局部毒性，能够穿透气- 血屏障的药物还会对其他脏器造成损伤，而不影响肺部。
通过跨膜渗透性能够评估药物发生全身性毒性的风险。同时，需要考虑药物在肺部的生物转化作用。选择合适的细胞类型需要全面地综合考虑，例如为了模拟纤维化，就需要选择上皮细胞和纤维母细胞建立有效的体外系统[35]。
支气管内表面被黏液覆盖，微粒不能轻易穿透黏液保护层，但许多体外模型并没有考虑这个因素，对风险评估的影响尚不明确。Murgia等强调了气- 液环境和液- 液环境的区别，在风险评估中这个因素是会影响颗粒穿透黏液效果的[35]。
纤毛清除同样会影响体内外相关性。在毒性试验中，没有一个模型能够满足所有的要求，因此需要结合不同模型进行综合评估。
3.2 3D 器官模型
3D 器官模型是将细胞以一定的比例和方式模拟人呼吸道的某个部分[29]。
例如采用来源于人体的细胞进行ALI 培养，模拟人体内呼吸道的生理屏障功能( 如跨上皮细胞电阻、紧密连接) 以及黏液分泌、纤毛清除功能，可用于感染、急性毒性或长期毒性的研究[36—37]。
随着3D 呼吸道器官模型的发展，新型和改良系统不断涌现，可以用于不同的吸入毒性研究，如MucilAir 和SmallAir (Epithelix Sàrl 公司)、EpiAirwayTM 和EpiAlveolarTM(MatTek 公司) 以及Micro-LungTM 和Metabo-LungTM(Cardiff大学)。
采用的细胞来源于健康志愿者或患者的鼻、气管/ 支气管上皮细胞、纤维母细胞、杯状细胞以及肺泡细胞等。
肺芯片系统能够预测人体肺部组织对外源性物质的反应。在微型聚合装置上包含了多层细胞培养舱，模拟气管、支气管和肺泡的立体微结构。
肺芯片装置能够通过呼吸循环和血流动力学模拟肺组织的动态微环境。此外，不同类型的细胞共培养能够模拟组织间复杂的相互作用，进而在器官水平上产生综合的生理响应[38]。
Huh 等设计的肺芯片模型能够模拟人体肺部的肺泡- 毛细血管单元，2 个平行的细胞培养舱之间由弹性的多孔薄膜隔离。
将人肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞共培养在薄膜的两侧，重建气- 血界面结构。
用计算机控制气体循环，模拟生理呼吸模式以及伴随的组织变形。该系统成功模拟了肺部感染和纳米粒子穿透肺泡- 毛细血管屏障的过程[39—40]。
Stucki 等应用肺芯片模拟肺泡细胞的拉伸，同时观察到荧光素钠的转运和白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8) 的释放随着细胞的拉伸而显著性升高[41]。
4
结语
随着影像学技术的发展，越来越多的研究利用软件拟合三维呼吸道结构，制造物理模型预测气溶胶在呼吸道内的沉积分布。
目前模型主要是基于对正常成人呼吸道的分析，当预测不同气流阻力的吸入制剂沉积时，需要考虑年龄、性别、疾病等对呼吸道结构的影响，以及这些影响导致的气溶胶沉积差异。
计算机模型在准确预测肺部沉积模式和药物浓度方面仍困难重重。
此外，在创新药或仿制药申报过程中，计算机模型预测结果尚不能被监管部门所接受。
预测安全性和体内过程的模型越来越多，针对不同的研究目的选择合适的模型至关重要。
不同模型的组合可以得到体内外相关性更好的数据，提升初筛的效率。选择体外模型需要考虑成本、复杂性、重复性、可获得性以及能否进行高通量试验，还需要考虑到人体可能的暴露情况，以及生物利用度和代谢清除作用。采用计算机模型优化体外研究结果，能使模型预测的结果更加可靠。
在吸入制剂的研发过程中，通过不同的体外模型建立IVIVC 预测吸入制剂在呼吸道的沉积、进入体内后的药代动力学以及安全性，能够节约研发的经济成本和时间成本。
参考文献
详见原文，
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2019, 50(1)
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