北大代谢组研究重大突破，郑乐民教授详解幕后故事！
郑乐民教授参与《肠·道》演讲
2 月 25 日，Gastroenterology 杂志上线了北京大学郑乐民教授及其团队的最新研究论文。我们在昨天的热心肠日报进行了解读：
北大郑乐民团队突破：全新的促脂肪肝肠道菌群代谢产物！
Gastroenterology[IF:19.233]
① 肠道菌群代谢物N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸（TMAVA）及其前体三甲基赖氨酸（TML），在脂肪肝患者血液中升高；② 粪肠球菌和铜绿假单胞菌可将TML代谢为TMAVA；③ 小鼠TMAVA处理可加重高脂喂养诱导的脂肪肝、引起菌群失调和不耐寒；④ TMAVA可结合并抑制γ-丁酰甜菜碱羟化酶（BBOX）抑制内源性肉碱合成，使小鼠体内肉碱水平降低，导致肝脏线粒体脂肪酸氧化减少，同时脂肪组织脂解增多，引起游离脂肪酸在肝脏积累；⑤ BBOX敲除小鼠在高脂喂养下同样出现体内肉碱缺乏、脂肪肝；⑥ 外源性补充肉碱可逆转TMAVA诱导的小鼠肝脏脂肪病变。
TMAVA, a Metabolite of Intestinal Microbes, Is Increased in Plasma From Patients With Liver Steatosis, Inhibits γ-butyrobetaine Hydroxylase, and Exacerbates Fatty Liver in Mice
02-25, doi: 10.1053/j.gastro.2020.02.033
【主编评语】肠道菌群可影响非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生和发展，但其背后的机制（特别是菌群代谢产物在其中的作用）仍需深入揭示。Gastroenterology最新发表了来自北京大学郑乐民团队的研究，通过队列研究和小鼠试验发现，一种新的肠道菌群代谢产物TMAVA（N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸）能通过影响肉碱合成和后续的脂肪酸氧化，来加重脂肪肝。这些发现为肠道菌群如何影响脂肪肝发生提供了一种新机制，也提示补充肉碱和靶向调节菌群或是治疗脂肪肝的新思路。（@mildbreeze）
今天，我们特别编发对郑乐民教授的书面专访。
专访中，我们请郑老师对该研究的背后故事、研究意义、未来应用以及研究经验等做了解读与分享。
以下是专访内容：
1.祝贺郑老师和团队发表重磅新研究，首次发现了一种能加重脂肪肝的新型肠道菌群代谢产物 TMAVA。能否请您简单介绍一下这个项目的由来，以及团队成员和大家在这项研究中的分工？
这个项目在 2014 年就开始进行了，因为我之前的研究主要集中在脂蛋白代谢——采用蛋白组学研究高密度脂蛋白的修饰和功能改变。14 年时我们想进军代谢领域，重点用代谢组学检测疾病中代谢物质的改变，在动物实验中研究机制。
TMAO 的故事提供了一个很好的研究范例。另外，由于我的博士是在 Cleveland Clinic（克利夫兰医学中心）读的，导师是 Stanley L.Hazen，在14 年时我们就快速建立起 TMAO 代谢通路的质谱检测方法，所以想是否可以按照 TMAO 的发现过程尝试新的菌群代谢物的寻找。
我们初期先用 15 例正常人和 15 例非酒精性脂肪肝患者进行了非靶向代谢组学的检测。
因为非靶向代谢组学没有完善的数据库，并且在 14 年的时候数据库相比现在更不完善，所以非靶向代谢组学一个关键难点是质谱检测出来的 m/z 很难确定是什么具体的代谢物。
我们根据质谱 raw data（原始数据）首先去确定每个 m/z 的峰形、积峰定量是否准确，在峰形和积峰定量准确的情况下，分析哪些 m/z 发生了改变。
我们看到很多 m/z 都发生了改变，其中有个物质（暂时命名为 “81”）的代谢谱图吸引了我们的注意，因为这个物质在质谱中有个离子碎片的 m/z 是 60.08。
研究 TMAO 的科研者都知道，60.08 是三甲胺基团的分子量，已经发现有重要功能的肉碱（carnitine），胆碱（choline），甜菜碱（betaine）和丁基甜菜碱（butyrobetaine）都有这个特征碎裂片段。
我们当时觉得这个物质可能类似已经报导的物质，和肠道菌群代谢相关，是 TMAO 的上游，比较类似 2014 年发表在 Cell Metabolism 上丁基甜菜碱的研究（Koeth et al., 2014）。
于是我们就尝试性地给小鼠进行四联抗生素干预发现，抗生素干预 4 周后 “81” 的水平果然和 TMAO 同样降得很低，我们就觉得这个物质可能比较重要。
不过在此时我们还没有确定这个物质的具体结构，我们只知道这个物质的碎片离子，所以下一步的重要工作就是确定“81”的具体结构。
这也有赖于我本科是化学专业和北大强大的多学科优势，咨询了很多化学合成的朋友，最后在北医药学院孟祥豹教授的帮助下进一步推测“81”的结构式，进行合成，终于确定“81”是三甲基五氨基戊酸。
从 2015 年年初到 2016 年暑假，这个过程整整持续了一年半。有了代谢物，我们才进行下一步的动物研究。
这个研究最开始就是我的博士研究生赵明明来做的，他从 2013 年本科毕业设计就提前来实验室学习，2014 年就开始做这个研究，所以从刚开始的发现到后期动物实验验证基本由他主导完成。
在 2019 年 7 月份 Gastroenterology（胃肠病学杂志）的修稿意见中编辑和审稿人的整体评价是研究逻辑很好，动物实验也很扎实，最大的问题是 TMAVA 在临床中的应用。
为了回答这个问题，我们有幸得到了复旦大学附属中山医院的赵琳博士的帮助，在非酒精性脂肪肝患者中进行了检测和验证。
像我前面提到的很多实验，包括 TMAVA 的鉴定与合成、特定菌株的预测、 DavA 和 DavB 纯化蛋白的验证、分子结合力实验、动物脂解实验都得到很多教授（密歇根大学陈育庆教授，北京大学尹玉新和郭雪峰教授，澳大利亚新南威尔士大学杨宏远教授）的指导和帮助，在这里也一并感谢。
郑乐民教授及其团队
2.您觉得这项研究中最重要的突破有哪些？最有意思的发现又是什么？研究过程中有没有什么有意思的插曲？
我们觉得这项研究中我们最重要的突破是再次推进了肠道活性代谢产物的研究，并且在动物和分子机制方面阐明了代谢物的作用。除了 TMAVA 本身的鉴定比较有意思外，我们觉得在寻找 TMAVA 前体 TML 时也比较有意思。
我们第一次发现这个 TMAVA 时，它的分子量恰巧与一个药物的分子量相等，我们购买了药物的标准品，发现色谱保留时间不同。
在确定 TMAVA 由肠道菌群代谢产生后，下一步的关键是找到 TMAVA 的前体，而根据产物推测前体没有成熟的研究方法，我们就从 TMAVA 结构式入手，用 TMAVA 类似的物质检索文献。
无意间发现一篇文章报道：赖氨酸（lysine）可以通过菌群中 DavA 和 DavB 两个酶产生五氨基戊酸（Liu et al., 2014），而 TMAVA 比五氨基戊酸多三个甲基，因此我们推测三甲基赖氨酸 TML 是不是可以在类似酶体系下产生 TMAVA。
非常巧合的是，“lysine 通过 DavA 和 DavB 两个酶产生五氨基戊酸”的研究者是山东大学马翠卿教授，通过马教授赠予的 DavA 和 DavB 这两个纯化蛋白，我们发现在体外实验中，TML 可以产生 TMAVA。
赖氨酸经 DavA 和 DavB 产生五氨基戊酸
3.TMAO（氧化三甲胺）是近几年来肠道菌群研究中的“明星”代谢产物，从流行病学到分子机制到开发靶向性药物，可谓是菌群代谢物研究的一个范例。您觉得 TMAVA 会不会成为下一个 TMAO？您和团队接下来会开展哪些后续研究？
目前相关的心脏的临床研究，正在和华中科技大学附属同济医院一起进行，临床结果希望今年能够和大家分享，同时我们也做了大量的动物实验，相关的心血管的数据也希望尽早和大家分享。
关于 TMAVA 虽然我们做了将近 5 年的研究，但是我们现在只能判断它是肠道菌群代谢的产物，并且饮食中含有的 TML 可以产生 TMAVA。
TMAVA 有抑制肉碱合成、导致脂肪肝作用。但是 TMAVA 是否还有其他的生物学功能或者类似 TMAO 有这么多的病生理作用还需要同领域的研究人员进一步发现和证明。
我们发现 TMAVA 能通过和 BBOX 结合抑制肉碱的内源性合成，由于时间的紧迫性，我们只在 BBOX 全身敲除的动物上进行了验证。
如我们文章中提到的，虽然说 BBOX 在肝脏的表达是最主要的，但是其他器官也有不同程度的表达。因此我们现在已经制备了 BBOX flox 小鼠，接下来我们将在动物上验证不同器官 BBOX 的表达对机体代谢的影响。
其次，我们虽然在动物实验中发现给予肉碱会逆转 TMAVA 的疾病效应，但是真正在人群中是不是有效的，还需要进一步的临床随机试验。特别是肉碱在某类脂肪肝病人上的应用，可能具有很大的市场前景。
第三，我们现在主要认为 TMAVA 通过抑制肉碱的合成发挥作用，但是 TMAVA 是否还有其他的信号通路，包括和其他蛋白的结合，特别是不是会和 TMAO 类似也存在细胞膜受体，这些都是我们下一步研究的方向，也希望同领域的研究人员进一步发现。
4.TMAVA 的前体三甲基赖氨酸（TML）主要常见于哪些饮食（或药物）？这项研究发现对于预防脂肪肝有哪些启示？在临床转化方面有哪些应用前景？
当时我们通过物质结构式推测 TML 是 TMAVA 的前体，同时在文献中检索 TML 的相关资料。
Hazen 团队在 2018 年 JCI insight 上发表了一篇文献对我们启发很大（Li et al., 2018）。他们通过非靶向代谢组学发现 TML 是冠心病的独立风险因素，并且独立于 TMAO。在这篇文章中详细分析了不同食物中 TML 的含量，他们发现一些海产品和肉类食物中含量较高。
因为 TML 需要经过肠道菌群产生 TMAVA，所以饮食中 TML 产生多少含量的 TMAVA 和肠道菌群密切相关。在饮食方面最重要的还是做到均衡饮食，而对 TMAVA 的产生更多的应该从肠道调节的角度思考，类似 TMAO 研究中通过 3,3-dimethyl-1-butanol（DMB）抑制肠道微生物中 TMA 裂解酶抑制 TMA 的产生，进一步降低 TMAO 的水平。
因此我们现在也在尝试通过用益生菌或益生元改变肠道菌群，或是直接抑制参与 TMAVA 产生的微生物酶，都有可能降低非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生风险。
总之益生菌的作用很大，市场前景也很大，但是我们需要进一步来研究每种益生菌的特异性功能。
5.在肠道菌群研究领域中，已有不少研究团队将目光投向了代谢组学，包括您和团队的这项研究，也是通过代谢组分析发现了 TMAVA。可否请您分享一下这方面的研究经验？代谢组学是否会成为接下来肠道菌群研究的主旋律？
代谢组学以“无偏见”（unbiased）的方式比较广谱的筛选代谢物，非常适用于复杂疾病的研究。因此在代谢研究领域，通过质谱进行代谢物的筛选和检测是个极其重要的手段。我们这个研究的线索也是代谢组学提供的。
代谢组学是个有力的研究工具，但现在关于非靶向代谢组仍有亟待解决的问题。
首先，由于代谢在人体和动物体内是很容易发生改变的，因此做非靶向代谢组学时样品的质量和匹配非常重要。
其次，在非靶向代谢组学本身方面，现在非靶向代谢组学可以一针检测 5000+个m/z 的离子，但是数据库能匹配到的明确代谢物一般在 1000 个以下。在这个过程中还存在错配、m/z 的峰面积的不准确性，这些非常重要的问题。
而要解决这个问题，我们一方面在追求代谢物数据库的不断完善，或者多个数据库的相互验证包括在线数据库 METLIN、HMDB 和不同实验室或者质谱厂家 in-house 的数据库。
但是由于不同仪器检测时的参数不同，导致碎片离子或者离子强度不同，所以仍然导致一定的结果不可信。
另一方面就需要研究人员对照原始谱图进行人工复核，这个操作涉及的数据量是巨大的，需要消耗很大的精力。如果复核发现存有差异，要再通过标准品进行验证。
一般通过非靶向代谢组学找到差异代谢物后，再通过靶向代谢组学并扩大样品量，以提高检测准确性和灵敏度，发挥靶向组学在对目标代谢物的检测上所具有的无与伦比的优势。
靶向代谢组学是精准医学的重要组成部分，会对人民群众的健康以及慢性病的监控产生巨大影响，它已经成为继基因检测、蛋白检测之后重要的体外检测方法。
因此代谢组学不仅仅是肠道菌群研究重要手段，也是代谢领域研究重要的研究手段。但是刚刚提到的非靶向代谢组学存在的难题，还需要代谢和质谱领域的研究人员不断完善解决。
另外，我们将通过和佰辰医疗的合作，让肠道菌群的代谢测试尽快应用到疾病的检测中，为菌群的疾病研究提供更为精准的标准，也为菌群相关的食品、保健品，甚至药品提供更有效的测量标准。
采访中涉及的文献：
1.Koeth, R.A., Levison, B.S., Culley, M.K., Buffa, J.A.,Wang, Z., Gregory, J.C., Org, E., Wu, Y., Li, L., Smith, J.D., et al. (2014).gamma-Butyrobetaine is a proatherogenic intermediate in gut microbialmetabolism of L-carnitine to TMAO. Cell Metab 20, 799-812.
2.Li, X.S., Wang, Z., Cajka, T., Buffa, J.A., Nemet, I.,Hurd, A.G., Gu, X., Skye, S.M., Roberts, A.B., Wu, Y., et al. (2018).Untargeted metabolomics identifies trimethyllysine, a TMAO-producing nutrientprecursor, as a predictor of incident cardiovascular disease risk. JCI Insight3.
3.Liu, P., Zhang, H., Lv, M., Hu, M., Li, Z., Gao, C.,Xu, P., and Ma, C. (2014). Enzymatic production of 5-aminovalerate fromL-lysine using L-lysine monooxygenase and 5-aminovaleramide amidohydrolase. SciRep 4, 5657.