陈廷涛：改造益生菌甚至病原菌，真能成抗癌降糖良药？
各位同道大家下午好，我是来自南昌大学转化医学研究院的陈廷涛。
我今天跟大家分享的内容是工程细菌在健康领域的应用。
本演讲的幻灯片 .pdf 版将在热心肠菌群微信群分享，感兴趣的读者请按以下方法申请入群：
简单来讲呢，其实微生物在以前的时候并不是一个强势学科。以前大家研究的重点主要是微生物的分类学以及流行病学，再一个就是传统的发酵食品，还有一个就是微生物发酵以及代谢产物方面。
和健康相关的研究，一是比较少，再一个是研究档次也并不是很高。
但是随着高通量技术的发展，微生物已经成为了一些顶尖杂志封面的常客。此外， 世界各国也在紧密的布局微生物健康计划，比如说肠道菌群的检测、食品、保健品、药品，工程菌株也有所涉及。
提到微生物，我们不得不说一些研究技术：宏基因组学和高通量测序可以揭示肠道微生态系统的不同信息层级，揭示肠道微生物的组成。多组学，比如说转录组学、蛋白组学和代谢组学也逐渐被联合应用在揭示微生物作用上面。
但是，组学的一些缺陷我们一定要认识清楚。
打个简单的比方，高通量测序可能有以下一些弊端：
第一个就是宿主之间的个体差异。
再一个就是 DNA 提取方法，有一些细菌 DNA 是特别难提取到的。
第三个就是引物扩增方面，引物偏好性会把一个错误放大到百万倍以上。
最后一个就是说，我们拿到微生物的序列，然后我们会拿到 NCBI 里面去比对，在 NCBI 比对的时候，这一个序列可能会给你几百种不同微生物的信息出来。
怎么去合适的选择到这个微生物是不是我们需要的，这也是非常重要一件事情。因此来讲，多组学的应用给我们研究微生物提供了很好的一个方法，但是，我们一定要正确去解读这些结果，一定要经过一些严格的验证。
人体微生态系统现在研究比较多的就是胃肠道、泌尿生殖道和口腔。
此外，肿瘤、大脑、胎盘、子宫、乳汁和肺在这些大家以前认为没有微生物的地方，也发现了微生物的存在。其中一个很关键的部位就是胎盘，因为胎盘是否有微生物的争议比较多。
胎盘微生物的研究，我们其实也做了一些工作。我记得是在 2011 年的时候，我们对小鼠的血液、胎盘和羊水里面的微生物进行了检测。我们活检技术的结果表明，胎盘里面确实有微生物的存在，而且主要是肠球菌和乳酸菌存在。
再一个就是肿瘤，今年 Science 发了一篇文章，证明肿瘤里边是有微生物的存在，而且种类是不同的。
我们在 16 还是 17 年的时候，我们也做了一个相关的工作。当时我们的想法比较朴素，比较了一下小鼠肿瘤和人体肿瘤的不同，看看能不能找到一个微生物，它既存在于人的肿瘤里边，也可以存在于小鼠的肿瘤里边，这样的话我们就可以把它作为一个标识物或者作为一个靶标。
因此来讲的话，肿瘤、大脑、胎盘、子宫、乳汁和肺对这些部位的细菌的认识，我觉得是非常重要的。
为什么这么说呢？如果说我们能从这些部位找到一种特殊的细菌，而这个细菌只存在于这个部位，我们就可以把它开发成一种药物的载体，靶向治疗这些相关的疾病。
基于肠道微生物组的治疗方法现在有很多，其中我认为最重要的一点就是饮食干预：如果我们保持一个很好的饮食习惯、一个良好的运动习惯以及保持一个特别好的心情，我觉得这是我们人体保持健康的最重要的一个方式。
如果说我们发生了疾病那怎么办呢？
其中最重要的两个治病方式就是粪菌移植和益生菌。此外还有噬菌体疗法，以前是有这个疗法，但是后来的时候逐渐被抗生素替代，但是现在它又焕发了第二春；再一个是菌群的代谢产物；还有一些肠道屏障相关的一些药物。
我着重讲一下粪菌移植和益生菌。
粪菌移植的好处是它可以恢复肠道菌群多样性，避免长期使用抗生素引起的耐药性。但是有一些东西，比如说作用机制、给药的方式、随访时长 、准备方式、供体的选择，还有监管，可能会影响粪菌移植的效果，给它的推广就造成了一定的困难。
说到粪菌移植，其实我们还可以听另外一个概念——阴道菌群移植，阴道菌群移植和粪菌移植也是一样的。
在 2016 年的时候，我们想开展阴道菌群移植，但是最终伦理都没有通过。没有通过的原因我们也非常理解，因为妇女阴道里面可能存在一个病毒，就是 HIV 病毒，它的潜伏期在 8~20 年。如果说供体里边有这个病毒的话，很可能会对受体造成特别大的影响，这就给我们一个很重要的提示：怎么去规避当前一些政策和创新性上的问题。
下面我们讲一下益生菌。
益生菌其实大家现在认可度还是非常高的，因为它有临床数据的支持，而且这些传统菌株也有一个较长的安全记录。
但是菌株和被试个体之间的差异性、重症病人之间可能出现的败血症以及下一代益生菌缺乏安全记录可能都会导致后面开发的一些困难。
我着重讲一下益生菌药品。
我们知道中国可能是有十几个益生菌的药品，它们是在十几到二十几年前被批准，当时的一些监管体制、技术手段相对来讲比较落后，可能会给这些益生菌产品造成后续的麻烦。
比如说，菌株可能会出现标识不明的问题。再一个，有一些可能对人体有隐患的菌株，比如说，粪肠球菌的使用。第三个就说是生产性能，比如说，活菌数以及它的保质期问题。
现在进入我们的主题就是工程菌，它的定义就是通过基因工程改造后使外源基因得到高效表达的菌株。
工程菌第一具有宿主菌本身的一个效果；第二个它会表达外源蛋白，因此它又具备了外源蛋白的功效，它可能是将来开发的一个热点和重点。
现在来讲，它已经在肿瘤、糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝、皮肤性创伤以及神经性疾病中都得到了应用。
工程菌构建主要有两种方式，一种是质粒过表达型，再一种是基因整合型。
质粒过表达型的优势是构造相对简单，表达量又高；基因改造型是把基因插入到细菌的 DNA 里面去，因此来讲，它的拷贝数就比较少，它的表达量相对较少一点。
质粒表达型也有它的劣势：质粒可能会有一个不稳定性；再一个，某些质粒可能会带有一些耐药性基因，也有可能会有一些安全隐患。
所以在我们开发时候一定要衡量它们的异同，进行选择。
目前很多工程菌已经在临床上得到应用。主要是有这么几大类：第一类就是乳酸乳球菌，再一个李斯特菌，还有一个就是鼠伤寒沙门氏菌，还有一个是大肠杆菌，再一个就是长双歧杆菌。
鼠伤寒沙门氏菌和李斯特菌其实很早以前就已经被用于一些药物的开发，它们主要的机制就是它们会表达一些抗原，而抗原在机体内表达之后会引起机体的免疫反应，这些诱导的抗体就可能会有效地对抗外来细菌的感染或者病毒的感染。
我们主要讲一下益生菌工程菌。
上面说到乳酸乳球菌，它并不是一个肠道内的原住民，它反倒在肠道里面定植能力特别差，大家为什么还要用乳酸乳球菌来作为工程菌株呢？原因很简单，因为乳酸乳球菌是现在乳酸菌属里边研究相对比较多的一个菌株，质粒特别容易转化进去，所以技术难度相对小一点。
双歧杆菌类要比乳酸菌还要难做，但是双歧杆菌、长双歧杆菌的生长性能特别好，它也有对应的一些质粒改造，常常被用来作为工程菌来进行开发。
下面我们着重介绍一下大肠杆菌 1917，因为大肠杆菌是迄今为止所有的细菌中研究背景最清楚、研究技术最容易实现的一个菌株。
现在我们看上图红框线中大肠杆菌 1917 的三株菌，一个外国公司把它开发成了多种药物。其中有的已经上了临床，我们看到它的工程菌治疗高血压的案例，其实是在热心肠上面进行了报道。当时我看这个消息的时候是特别的兴奋，因为当时我们也在做工程菌，但是我们面临一个很大的问题——就是中国的法律法规。
关于工程菌在健康领域的治疗基本上就没有，当时看到这个案例之后，我们就特别兴奋。因为起码来讲，他们已经突破了工程菌在健康领域的使用的这个法律法规的障碍。那就意味着，将来我们要开发工程菌的时候，我们就可以拿这个案例来进行政策上的突破。
后来这个菌在 3 期临床上失败掉了，当时给我的感觉就是用两句话来概括：就是意料之外，情理之中。
为什么说意料之外呢？因为我本身还是真的希望它能成功，如果它能成功的话，它会作为第一个工程菌株在健康领域的应用案例，为我们后边开发工程菌株减少了好多政策上的困难。
但是为什么说情理之中呢？因为大肠杆菌是有很多缺陷的。
打个比方，质粒表达型的菌株有好几个困难：
第一个呢，它表达蛋白分子超过 10kd 的话，那基本上它就很难在原核表达系统里进行表达。
第二个就是不管表达蛋白多大，它的表达量是非常少的，这也是一个困难。
还有一个问题就是直接过表达的一些蛋白，生成较快的时候，它会以包涵体的形式产生，而包涵体我们知道是没有活性的。
再一个，蛋白经大肠杆菌的表达出来之后，大肠杆菌是不会对蛋白进行修饰的，因为蛋白表达出来之后需要进行一个糖基化的修饰，只有修饰后它才会有活性，如果说是没有修饰的话，基本上蛋白表达可能是没有用的。
因此以上种种的原因可能就是工程菌失败的原因。
但是还有一个问题，如果说工程菌株在体外效果特别好，然而当它进入到体内的时候是不是能像我们预期的那样去发挥它的功效。因为我们要知道，我们肠道的环境还是非常严苛的，这时候工程菌可能更多的精力是放在怎么去生存上，而不是怎么去表达这个目的蛋白。
现在讲讲我们的一个工作，主要讲一下细菌疗法。在 2018 年的时候，肿瘤患者数量在 380.4 万，实体瘤是占了非常大的一部分，当前实体瘤的治疗方法主要有手术治疗、放疗、化疗，还有免疫治疗。
手术治疗对全身已经扩散的患者基本上是没有什么效果的。
放疗、化疗我们也很清楚，它们的毒副作用非常大。
再一个就是免疫治疗，PD-1 抑制剂现在被应用于治疗实体瘤，然后效果也特别好，但是它的有效率相对比较低，可能在 20%左右，它也有相当大的毒性。
因此这就给我们一个问题：我们有没有可能用其它方式来治疗这个肿瘤？
早在 19 世纪的时候，人们发现有一些肿瘤患者在被细菌感染之后，发现他的肿瘤缩小，甚至说是完全消失了。
然后，他们从肿瘤里面进行微生物分离，发现原来这个梭菌是一个“罪魁祸首”，而且可能是导致肿瘤减少的一个很大的原因，因此他们把梭菌分离出来之后，就给这些患者去注射，结果发现，很多人也死掉了。
为什么呢？因为毕竟梭菌是个致病菌，过多注射的话，有可能引起细菌感染而导致死亡。
除了发现梭菌之外，人们还发现了很多其它细菌具有这样的功效。鼠伤寒沙门氏菌就是其中的一个，它可以是营瘤内寄生，可以在瘤内进行大量繁殖。
但是鼠伤寒沙门氏菌同样也是一个致病菌，它主要的一个致病的因素就是 LPS——也就是脂多糖，它是有 8 个单位构成，科学家把它去掉 2 个单位，只剩 6 个，大大把这个毒性给减小了；此外还保留了它在肿瘤内定植的特性。
因此，我们就用减毒鼠伤寒沙门氏菌做了我们的工作。
首先我们把一个原核表达质粒转入到鼠伤寒沙门氏菌里面去，这个原核质粒是带了一个人源化的毒素。
当这个细菌通过腹腔注射 、尾静脉注射或者说是口服之后，它会进入到宿主的血液。
进入血液之后，它会进一步进入到宿主的肿瘤内部，再进入到肿瘤细胞内部。
在生长的过程中，有一些鼠伤寒沙门氏菌会死掉，这时候它就会把质粒释放出来，而这个肿瘤细胞这时候就可以利用鼠伤寒沙门氏菌释放出来的真核表达载体然后去生成毒素，最终把自己给杀死。
这是它的一个作用机制。
当时还有一个小故事，我们菌株构建完成之后，因为我要出去外地学习，对它进行了第一次尾静脉注射之后 ，我就出去了，之后留给了学生去观察。
当两星期之后我回来的时候，学生跟我讲肿瘤完全消失了，我就看了一下，当时我们只是做预实验，所以只做了两只老鼠，两只老鼠上面的肿瘤就完全都消失掉了。
所以当时看了特别兴奋，我直接就抱着鼠笼，然后跑到了辛洪波老师那边去跟他汇报这个事情，之后我们这个细菌疗法研究就轰轰烈烈开展起来了。
当前我们现在做了好几套系统，后面会有一个介绍。
再一个我们讲一下 GLP-1 工程菌。
GLP-1 是由肠道 L 细胞生产的一个小肽，它的主要功效其实有 4 个：第一个是可以治疗糖尿病，第二个它可以减肥，第三个它可以发挥降脂降血压的作用，第四个它对精神疾病也有非常大的一个作用。其中我用红色标注的降糖和减肥的功效，其实在 FDA 都已经批准了。
但是 GLP-1 同样有它的一个缺陷：GLP-1 半衰期特别短，它会被 DPP-IV 这个酶快速降解掉。
GLP-1 开发的重点就是如何去延长它的半衰期。这时候我们在想：我们能不能通过让细菌源源不断表达 GLP-1 小肽，最终达到一个治疗的目的呢？所以说我们就开始了这个工作。
幸运的是在 2019 年 5 月份的时候，一个公司研发了一款 GLP-1 口服药，证明口服这种途径是完全行得通的。
然后菌株构建完成之后呢，我们做了它和糖尿病的相关研究，也做了它和肥胖的一个相关研究，也做了它和精神疾病的相关研究。
阿尔茨海默症和帕金森的这两个研究都已经发表，在热心肠公众号上面可以搜索到。
但是我们做它与减肥和糖尿病方面的工作，现在我们还没发表。其实这两个工作开始得最早，但是为什么没有发表呢？因为我们将来开发的重点，我们是想去往糖尿病和肥胖上面去开发。
第一个它受众比较多，第二个意义也比较大，再一个就是说它很好观察：因为糖尿病很简单——血糖降了，它就是有降糖作用，肥胖也很简单——体重下降了，它就有降重的一个效果。
我们已经做了猴子实验，当然我们做的比较少，做了三只猴子，就证明在给药两个星期的时候，猴子的血糖就会恢复到正常。
除了上面讲的两个工作之外，我们还做了一个乳酸菌表达系统，它主要表达一个趋化因子，趋化因子会招募一些免疫细胞过来，然后本身乳酸菌产生的酸也会有抗感染作用，因此它对烧烫伤、还有一些创伤，包括宫腔黏连，都有比较好的一个效果。
另外，我们用大肠杆菌表达系统来表达金属硫蛋白，而金属硫蛋白对一些重金属的污染非常有效果。
至于治疗糖尿病的工程菌株，我们现在做了好几套。比如说，大肠杆菌、乳酸乳球菌，还有植物乳酸杆菌，我们都做了，质粒过表达型也做了，然后基因型我们也在做，希望说有一个好的效果。
再一个就是抗肿瘤方面。实体瘤方面，我们大肠杆菌也做了，减毒鼠伤寒沙门氏菌也做了。其中减毒鼠伤寒沙门氏菌，我们是做了 4 套毒素系统、2 套双靶向和 3 套免疫。
毒素系统我们做的最多，它的效果是特别好，基本上 30%左右的肿瘤就会完全消失掉。
我们为什么要做这么多套呢？原因很简单，因为我们在做的过程中发现老鼠可能会对减毒鼠伤寒沙门氏菌工程菌会有耐药性的产生，几个月后老鼠的肿瘤会复发，因此我们多做了好几套。比如说这套菌耐药的时候，我们看看尝试另外一套菌去做。
另外免疫方面，其实我们主要是合成 PD-1 还有 CTLA-4 免疫抑制点的单链抗体。
以上就是我们现在做的工作。
其实中国基因改造这一块是非常强，山东大学微生物重点实验室、中科院的几个实验室、四川大学，还有四川农业大学，包括江南大学以前的益生菌改造这一块儿，其实都非常的厉害。
我们也希望通过这个报告认识更多的同道中人，然后一起把工程菌株争取能开发一两个具有中国自主知识产权的药品，以上是我的汇报内容。
感谢聆听！