庾庆华：22分钟详解菌群如何调控肠道干细胞
大家好，我是来自南京农业大学动物医学院的庾庆华。非常感谢热心肠研究院的邀请，让我有机会和大家一起分享。我今天汇报的主题是《好菌，好肠道，好健康》。
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俗话说：“病从口入”。我们现在知道，这个“病”并不局限于病原微生物。
像很多环境污染等致病因素，比如说像重金属镉，它主要是在矿石和化工生产以及汽车尾气排放中会有所产生。此外，像我们很多的化妆品、香烟和贝壳类水产品中，也经常会被检测到镉含量超标。
镉能够污染空气、水和土地，并且通过食物链进入畜禽产品，危害人类。而目前中国等发展中国家，由于其工业生产及需要，重金属镉污染仍然较为严重。此外在畜禽养殖中，饲料中镉浓度超标，会导致畜禽中毒时有发生。
镉具有致畸、致癌和致突变的生物毒性，它的生物半衰期最长可达到 30 年，所以人一旦摄取镉之后，很难将其排泄，它会危害我们人类的多种器官。镉被摄取之后，首先接触到的是肠道器官，它能够损伤肠上皮细胞，并且诱发肠炎。
讲到肠炎，在人类中，炎症性肠病 IBD 和肠易激综合征 IBS 已成为全球性疾病。有研究证实，大概有 10~15%的 IBD 患者，会因肠的“炎-癌”转化死于结直肠癌。
除了人类，动物也有非常严重的肠道疾病。
比如说像猪、鸡、牛、羊等畜禽动物，它们的腹泻和肠炎会困扰整个养殖周期。而伴侣动物——像猫和狗，它们跟人类一样，也逐渐进入一个老龄化的过程，像高血压、高血脂、肠道疾病，也会困扰着狗和猫。野生动物，如金丝猴，它的肠道也非常的敏感，环境的改变和食物的改变容易导致猴子存在严重的腹泻问题。
此外，宠物主人患肠炎的概率，大概是不养宠物人士的 1.26 倍。
而在发生炎症状态下，肠干细胞的增殖和分化，来替代受损的肠黏膜上皮细胞，是改善肠炎的关键步骤。
肠隐窝处的肠干细胞具有持续增殖能力，在向肠绒毛顶端迁移过程中，会分化成不同类型的肠黏膜上皮。有研究证实，黏膜上皮之间的潘氏细胞和上皮下的肌样成纤维细胞，可以分泌表皮生长因子等特定的细胞因子，从而调控肠干细胞的增殖。
目前，肠道菌群调控肠干细胞是一个研究热点。
因为肠道与机体大部分的干细胞所处的环境不一样，肠道是开放的，肠黏膜屏障游离面的肠道菌群、摄取的重金属等能够与肠道干细胞持续地相互作用，但是它们之间的相互作用关系尚未被完全揭示。
2016 年有研究证实，共生菌的一种主要代谢产物——丁酸，在一定的生理浓度条件下，能够依赖于转录因子 FoxO3，来抑制肠道干细胞和祖细胞的增殖；而在稳态状态下，分化的结肠细胞能够代谢丁酸，降低肠道中丁酸的浓度，来保护肠隐窝处的干细胞。
这个研究给我们做了一个提示，肠道从肠的内容物、从绒毛到基底部的隐窝，它是一个立体的空间结构，我们在研究益生菌及其代谢产物的时候，要同样注意这个空间层次。
比如说，我们最近在研究氧气的变化，同样需要关注游离面和隐窝处，它的氧气浓度是不一样的，其潜在对干细胞的调控性能，包括对上皮细胞的影响，也具有空间层次。
2018 年有研究证实，植物乳杆菌产生的乳酸能够激活 GPR81 受体，来诱导基质细胞和潘氏细胞分泌 Wnt3 这种细胞因子，从而激活 Wnt/β-catenin 信号通路，来促进肠干细胞介导的上皮细胞再生。
肠开放性的干细胞到底怎么应对各种环境的挑战呢？
我们在前期的研究中发现，给小鼠饲喂镉之后，能够抑制小鼠的正常生长，并且诱发了典型的小鼠肠道炎症症状。
在这个过程中，我们更有意思地发现，镉能够导致肠道分泌型细胞数量减少，并且其分泌的黏液蛋白和溶酶体的表达水平都有所降低。
进一步研究发现，镉主要是通过诱导活性氧的产生，来激活 Notch 信号通路，调控肠干细胞的分化，导致分泌型细胞——像杯状细胞和潘氏细胞及其分泌量会有所减小。
最主要的是，它能够增加肠道病原的易感性。我们在小鼠实验中发现，正常的小鼠大概需要 1 亿个病原菌——比如说李斯特杆菌、沙门氏菌，才能够导致小鼠死亡；而在镉污染的状态下，只要 100 个病原菌，就能够引起小鼠的严重死亡情况。
这个研究提醒，处于镉生产、或者能够接触到镉的一些人，他们的日常饮食的食物安全层级，应该得到更多的关注。
既然“病从口入”，我们也在想，是不是也能“病从口防”？
目前选择的研究靶点之一就是益生菌，很多的研究证实，益生菌有各种各样的益生作用，从而被广泛应用。
但实际上，益生菌仍然有很多问题，或者是存在的机制，有待于我们进一步探索。
比如说，益生菌能否定植，存活的质量如何？益生菌大概饲喂多久才能发挥作用？它在不同的肠段，以及跟其它微生物之间，是否能够有相互作用？益生菌的作用机制，仍然有待于全面解析。
我今天重点会给大家讲解三种益生菌。
第一是嗜酸乳杆菌，它普遍存在于人和动物的口腔、肠道和阴道等部位，可以降解乳糖，能够抑制白色念珠球菌和金黄色葡萄球菌等特定的病原菌。此外，它能够缓解抑郁，改善 IBS 和 IBD 等肠道炎症，目前被广泛应用。
2018 年的两篇研究分别证实，嗜酸乳杆菌 NCFM 这一株菌，能够促进肠道上皮细胞阿片样受体和大麻素受体的表达水平，介导类似吗啡的镇痛作用；而嗜酸乳杆菌 LA1 这一株能够干扰内质网应激，来抑制 NF‐κB 通路，改善 DSS（葡聚糖硫酸钠盐）诱导的肠炎。
所以，我们可以看到，同样是嗜酸乳杆菌，不同的菌株，它的主要的益生功能可能是不一样的。
我们在研究中发现，嗜酸乳杆菌 4356 这一株能够通过 TLR2 受体，来缓解鼠伤寒沙门氏菌感染导致的 Wnt 信号通路的过度活化、隐窝异常增殖和分泌细胞的过度消耗，从而来维护肠黏膜屏障的完整性。
除了嗜酸乳杆菌，目前另外一种被广泛应用的乳杆菌就是罗伊氏乳杆菌。它最早归属于发酵乳杆菌，该菌几乎存在于所有的脊椎动物和哺乳动物的肠道内。
已有研究证实，罗伊氏乳杆菌能够增加丁酸的含量，来促进肠上皮细胞的增殖。此外，罗伊氏乳杆菌也被证实能够诱导耐受性 T 细胞的产生；改善动物肠道 pH 值和提高饲料的利用率；其代谢产物罗伊氏菌素可抑制有害病菌，来保护肠道微生态平衡。
但是，不同的罗伊氏乳杆菌菌株的生物学功能，同样存在差异。比如说 17648 这一株，它主要用于治疗幽门螺旋杆菌；而 30242 这一株，它最主要的益生功效是用来改善胆固醇。相应的菌株已经被做成保健品，被广泛应用。在我国，2003 年，卫生部也批准罗伊氏乳杆菌可作为人类保健品微生物菌种。
在上世纪 60 年代，有研究证实，我们人类的肠道中，大概 30~40%的人类菌群中，是含有罗伊氏乳杆菌的，但是现在这一菌群的比例已经下降到 10~20%，其下降的原因还仍然有待于进一步探索。
我们实验室在前期的研究过程中，从猪的肠道里边分离了一株罗伊氏乳杆菌 D8，它具有良好的耐酸和耐胆盐特性。我们在饲喂小鼠之后发现，它能够良好地定植于小鼠的肠道里边，并且能够刺激肠上皮细胞的增殖。
另外，这一株罗伊氏乳杆菌 D8 能够改善鼠类柠檬酸杆菌诱导的肠炎，而这种肠炎的改善是跟 Wnt 信号通路的激活相关。
同样，这一株罗伊氏乳杆菌能够改善 DSS 诱导的肠炎症状，从肠道形态结构、体重、炎症因子等多方面，这一株罗伊氏乳杆菌都展现了良好的肠炎保护性能。
为了进一步探索益生菌对肠干细胞的调控机制，我们利用了肠类器官模型。
自从 2009 年，Hans Clevers 团队利用 Lgr5 阳性的干细胞，在体外培养成球状 3D 肠道类器官结构之后，很多团队都对类器官模型做了很多的改善。
2019 年，有团队利用细胞外基质蛋白的缺失，去诱导肠类器官中肠上皮细胞极性的逆转，它能够使细胞顶端向外生长，而基底层细胞向里生长。这个改变对于我们实验室操作是非常便利的。
在 2020 年，有团队利用支架微芯片，可指引肠道干细胞自组织生成类似肠道的管形上皮层，并且进一步与外部泵送系统连通后，可清除死亡细胞，这样能够长时间地在实验室培养类器官模型。
类器官在培养的过程中，需要表皮生长因子、Noggin 和 R-spondin 这三种细胞因子，来维持它基本生长。
而我们在体外研究过程中发现，如果缺失 R-spondin，但是只要添加这一株罗伊氏乳杆菌，同样能够去激活 Wnt 信号通路，维持肠类器官的正常生长。这个应该是跟这一株罗伊氏乳杆菌能够去诱导 R-spondin 的高表达密切相关。
在改善类柠檬酸杆菌诱导的肠炎过程中，这一株罗伊氏乳杆菌同样可以激活 Wnt 信号通路，来修复受损的肠上皮细胞。
猪源的罗伊氏乳杆菌是不是在不同物种上也有效？
我们之前的研究发现，D8 这一株罗伊氏乳杆菌在鸡上并没有相应的调控性能。所以我们分离了一株鸡源的罗伊氏乳杆菌 22，通过研究证实，这一株罗伊氏乳杆菌可以激活 Wnt 信号通路，来刺激肠干细胞的增殖。
这个研究给我们一个提示，在不同物种上，它需要特定类型的罗伊氏乳杆菌，可能才能起到相应的益生作用。
在真实的肠道环境中，除了上皮细胞，在它基底层有大量免疫相关性的细胞。所以，我们在类器官的培养过程中，添加了固有层淋巴细胞。结果发现，EdU 的平均密度从 22%上升至 30%左右。那也就是告诉我们，大概有 7%左右的细胞增殖潜能是由固有层淋巴细胞所提供的。
根据已有的研究发现，白介素 22 能够促进肠上皮细胞的再生。所以我们接下去的研究证实了，这一株罗伊氏乳杆菌能够诱导固有层淋巴细胞高水平地去分泌白介素 22，从而激活 STAT3 信号通路，来刺激肠干细胞的增殖，维护肠黏膜屏障的完整性。
单一的益生菌饲喂之后，对动物肠道原有的菌群组成是否会有影响？我们发现，饲喂罗伊氏乳杆菌 D8 之后，它能够导致肠道中阿克曼菌数量增多。
这也就是我今天要讲的第三种益生菌。阿克曼菌被认为可能是下一代益生菌。它在健康的哺乳动物肠道菌群中，占比可以达到 3~5%；而在肥胖、糖尿病和肠炎等疾病患者和小鼠中，其数量会显著下降。
关于阿克曼菌对肥胖的调控，比利时鲁汶大学的 Patrice D Cani 团队做了一系列的杰出工作。
他们首先在 2013 年发现，在肥胖小鼠肠道中，阿克曼菌数量会显著降低；而额外地去添加阿克曼菌，可显著降低脂肪重量，并且恢复黏液厚度。
2016 年继续研究发现，低温巴氏消毒法杀死的阿克曼菌，或者其膜蛋白，同样能够减少小鼠的脂肪重量。
在去年（2019 年）的研究过程中，他们把阿克曼菌应用到人类上，发现灭活的阿克曼菌可显著改善超重/肥胖胰岛素抵抗者的多项代谢指标，并且安全性良好；而补充阿克曼活菌，则没有太明显的益处。
这个研究给我们做了一个提示，有益的微生物，它有时候并不一定需要活菌才能发挥作用，死菌也同样可能存在益生作用。
而在我们正在开展的研究过程中还发现，活的阿克曼菌在正常小鼠中并没有太明显的副作用，但是在免疫低下或者肠炎状态下的小鼠中，高剂量的阿克曼菌可能存在一定的危害性。
因为阿克曼菌毕竟是革兰氏阴性菌，其内毒素结构虽然已证实跟沙门氏菌等病原菌的 LPS 结构有所不同，但同样可能有一定的炎症诱导作用。所以关于阿克曼菌作为下一代益生菌的安全性，应该得到更多的探究。
除了肥胖方面，阿克曼菌也被研究证实，它可以诱导限菌小鼠特异性的 T 细胞应答，来促进 IgG1 抗体，来增强黏膜免疫功能。但是，在菌群复杂的小鼠中，阿克曼菌引起的T细胞应答存在个体差异。
我们人体，因每个人所处的环境和饮食不同，菌群结构也是不一样的，所以在益生菌上面，也需要同样存在精准治疗。
2020 年，有两篇研究证实，巴氏灭活的阿克曼菌可调节细胞毒性 T 细胞，来缓解小鼠的肠炎。
而南医大的张发明老师团队研究发现，健康中国人肠道菌群内，阿克曼菌的定植率和相对丰度均低于欧美人群；并且在 IBD 患者肠道内，阿克曼菌的定植率和相对丰度，同样会显著降低。因此他们推荐阿克曼菌和其他菌群的组合，可作为一种非侵入性诊断方法，来鉴别 IBD 和健康人群。
在中国，IBD 发生率呈明显上升趋势，所以我们需要一种良好的方法，去做 IBD 的早筛，所以这篇文章对于 IBD 早筛的建立，具有重要的临床指导意义。
阿克曼菌在小鼠和人体中，都被证实了具有良好的益生作用，在其他物种上是否有相应的功能？
从今年（2020 年）开始，农业部已经规定，在畜禽饲料中不能去添加抗生素。所以，如何来改善畜禽动物的肠道健康，将是今后的一个重点研究方向。
我们研究证实，在炎症状态下，阿克曼菌同样能够激活 Wnt 信号通路，来刺激上皮细胞的增殖，能够改善鸡白痢沙门氏菌诱导的肠炎症状。
目前，关于动物肠道的研究，更多的是选择小鼠。
我们来看一下肠黏膜屏障，它包括肠道菌群、肠的上皮结构和基底层的黏膜免疫，即“上中下”一个立体结构。
而猪的肠道生理结构、基因的同源性和菌群的相似性，与人更为接近，是研究医学肠道疾病的理想模型，具有重大的研究和应用价值。
我国将近有 14 亿人口，我们大部分人的肉制品来源是猪肉。今年（2020 年）由于非洲猪瘟的疫情，导致猪肉价格上涨，这关系到我们的国计民生。
因为猪的饲养环境不可能像人类那么干净，所以猪从出生到断奶、到整个饲养过程极易发生肠炎和腹泻症状。猪患肠炎之后会损伤肠上皮细胞，导致营养物质吸收障碍，猪就会长得慢，同时容易继发感染，容易生病。因此，如何保持仔猪的健康成长，是关系到猪产业和民生的问题。
我们研究发现，早期饲喂这一株罗伊氏乳杆菌 D8，能够促进猪肠黏膜结构的发育，来刺激肠上皮细胞的增殖，并且可显著增加杯状细胞的数量。这对于早期仔猪在免疫系统发育不完善的状态下，去增强其肠道免疫功能，去维护健康，是非常具有重要意义的。
最后，我对今天的报告做一些展望。
单个益生菌可改善肠炎的症状，但它背后的机制可能复杂多变。就拿干细胞为例，我们已有研究证实，它可以去调控 Wnt 和 STAT3 这两条信号通路。我们正在开展的研究也发现，罗伊氏乳杆菌同样能够调控干细胞的甲基化、肠道里边低氧诱导因子等等多种途径。此外，益生菌是否有副作用，也仍然有待于深入揭示。
当单个益生菌的作用机理阐释较为清晰之后，益生菌如何复合应用，其相应的标准和方法，仍然有待于深入探索。
而我们人因为饮食和环境不同，会造成肠道里面菌群有所差异，在使用益生菌的时候，要根据不同的个体精准应用，这也仍然有待于进一步开发。
最后我讲一下宠物，也就是我们伴侣动物，最主要是狗和猫。
目前市场上在售的宠物用的益生菌，更多的是选用人源的保健的益生菌菌株。但实际上我们拿猫为例，猫起源于沙漠动物，它是严格的肉食动物，它的肠道结构和摄取食物，跟人是不太一样的。因此，如何开发宠物专属的益生菌，目前仍然处于相对空白区域，这将是我们今后团队重点的研究方向之一。
我们这部分工作，是在动物黏膜免疫课题组杨倩老师的带领下去完成的。我们非常感谢国家自然科学基金和科技部重点研发计划的支持。
谢谢大家，我的报告到此为止！