扩增子图表解读6韦恩图：比较组间共有和特有OTU或分类单元

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背景介绍(Introduction)

宏基因组学

宏基因组学目前的主要研究方法包括：16S/ITS扩增子、宏基因组、宏转录组、宏蛋白组和宏代谢组，其中以扩增子研究应用最为广泛。

目的意义

本系列文章将带领大家结合较新的16S rDNA扩增子相关文献，来理解宏基因组16S rDNA扩增子文章中常用图表种类、图中基本信息，以及表明的结果。

主要内容

本系列文章内容包括：箱线图、散点图、热图、曼哈顿图、火山图、韦恩图、三元图和网络图等。

学习思路

1. 罗列知识点，熟悉专业名词，弄个脸熟，即使理解不深刻起码在阅读中不会有抵触情绪；

2. 结合具体文章读图，实战两三次，基本就是专业人士了。

知识点(Method)

韦恩图 Venn Diagram

Venn Diagram，也称维恩图、韦恩图、文氏图，用于显示元素集合重叠区域的图示。

韦图绘制工具

常用R语言的VennDiagram包绘制，输出PDF格式方便修改。此外还有非常多的在线工具，使用方便。详见“轻松绘制各种Venn图”

韦恩图在扩增子中用途

1. 展示各样品和组间共有、各组特有的OTU；由于此类结果缺少统计支持，假阳性率高，近年来使用越来越少。

2. 展示各组间差异OTU共有或特有情况；较常用。

3. 展示差异OTU所属的Taxonomy归类后的共有或特有情况；当在OTU水平重叠结果不好，可按分类学级别逐级向上找规律。

看图实战(Result)

示例1. 差异OTU共有或特有

Edwards, J., et al. (2015). PNAS Fig. 2B/C
这篇文章分析了水稻根不同区域的细菌组成，16S分析文章较系统的作品，两年被引用147次，推荐阅读。

图2.B/C 韦恩图展示根不同区域富集或下降的OTU的共有和特有情况

1. 图中元素解释

• 图顶部Enriched或Depleted标签代表OTU的类型，分别代表OTU是显著富集/上调，还是显著消减/下调；

• 两图中间图注颜色，紫、绿和蓝分别代表根际、根表和根内；

• 图中非重叠部分为每个组特有，图中重叠部分为重叠各组共有，并将数字标示在该范围内；如B中仅蓝绿重叠区的175代表仅在这两者在共有的OTU数量；而中间的96代表在三组中均共有的OTU。

1. 图表结果：图中显示根际、根表和根内，无论富集还是消减类型中大部分为共有的OTU；这一结果表明，根系微生物组的形成过程，可能是由根际、根表和根内逐步建立起来。

2. 经验和技巧：合适的颜色和透明度选择很重要；可以将各种标签也添加对应颜色更容易区分各组；多韦恩图并排，有利于进一步的比较和规律发现。

附图注原文：
Fig. 2. Rhizocompartments are enriched and depleted for certain OTUs. 

(A) Enrichment and depletion of the 27,147 OTUs included in the greenhouse experiment for each rhizospheric compartment compared with bulk soil controls as determined by differential abundance analysis. Each point represents an individual OTU, and the position along the y axis represents the abundance fold change compared with bulk soil. 

(B) Numbers of differentially enriched OTUs between each compartment compared with bulk soil. 

(C) Numbers of differentially depleted OTUs between each compartment.

示例2. 韦恩图比较共有细菌科

Lebeis, S. L., et al. (2015). Science 
这篇文章是Dangl组2015年Science，是最早植物人工重组菌群的文章，研究了植物水杨酸对微生物组的影响，开山之作值得阅读。

• 图1. 植物防御激素突变体改变根细菌群体。 D. 上图展示三种水杨酸(SA)下调突变体sid2, pad4和双突DEPS三种材料中差异科水平共有和特有情况。左图为共同富集的科、右图和共同下调的科；

• 图表结果：表明三种突变体在科水平上对细菌群体的调控规律的一致性较好，也进一步证明这些差异科的真实性；

• 作图经验：分类学上分为界、门、纲、目、科、属、种，还有人为定义的OTU，到底在那一层面进行Venn图比较。选择的原则是先用OTU，如果没有发现很好重叠，很可能是在更高级别分类水平的功能重叠，从底层属向上尝试。本研究是找到科水平有较好一致结果。

图注原文：
Fig. 1. Defense phytohormone mutants have altered root bacterial communities compared to wild-type plants.

 (A) Jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and ethylene mutants (names at left) derived from wildtype Col-0. Upward and downward black arrows at right, hyper- and hypo-immune mutants, respectively. 

(B) Phyla distributions were separated into sample fractions (Soil, Col-0 Rhizosphere, R, or Endophytic Compartment, EC) and plant genotypes. Shannon Diversity indices are listed above each bar. * indicates a phylum significantly lower than Col-0 EC at p<0.001; # indicates a phylum significantly higher than Col-0 EC at p<0.05; ^ indicates that JEN, EN, and NJ Firmicutes relative abundances were significantly lower than Col-0 EC at p<0.04; @ indicates Shannon Diversity Index significantly lower than Col-0 EC at p<0.001 (all ANOVA with post hoc Tukey test). 

(C) The phyla distribution (circles color-coded as in B) of bacterial families identified as either enriched or depleted in ECs of each mutant compared to Col-0. The number of families in each category is noted inside each donut. Groups defined by Monte Carlo testing of Manhattan distances. (D) Venn diagram showing the overlap of enriched (left) or depleted (right) Group 2 families from (B).

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