五彩进化树与热图更配-ggtree美颜进化树(宏基因组扩增子)
上周四转载了微生态的《一文读懂进化树》，一周阅读人数已经2600+，而且有还多人留言求美化教程，今天将发放福利第一弹，Y叔创建的R包——ggtree，进化树美化神器。
软件原文G Yu, DK Smith, H Zhu, Y Guan, TTY Lam. ggtree: an R package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. doi:10.1111/2041-210X.12628. 软件发表刚满一年，引用已经40次(Google scholar, 截止17年10月4日)，相当于Nature文章的平均引用水平。
研究基因功能的人建个树，需要找近缘物种、外类群十几至几十个物种，费N天的劲才能做个树。而宏基因组领域的人不用去收集其它物种，因为研究的对象本身就是成百上千的物种，为了方便阅读或展示主要信息，我们反而会挑选结果中前100以内的物种去分析并展示。这是我们绝对的优势。
文中使用所有文件下载链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d 。R代码在文件夹中ggtree.r文件，其它结果数据文件主要位于result目录，具体使用文件见代码部分，需要什么文件单独下载，文件内有整个扩增子分析流程，6G的数据，如果你网速快、硬盘大全下也可以。
本文的分析，是建立在扩增子分析流程基础上，想要了解每个文件的由来，请阅读《2扩增子分析流程：零基础自学-把握分析细节》。
筛选合适数量的物种
正如上面所説，扩增子结果有成千上万的OTU，全画是看清的。需要挑重点，怎么挑，才能数据量即不多，也不少呢？
我们在《扩增子分析解读6进化树》中构建了进化树result/rep_seqs.tree文件。这是基于全部的OTU，用于计算Alpha和Beta多样性的。我们需要筛选高丰度的OTU，构建进化树用于展示，比如丰度大于0.5%或0.1%。《扩增子分析解读7筛选进化树》中采用0.1%丰度筛选获得104条序列，其实还是有点多，因为过百的序列展示过于密集，人类读起来有困难，用于圈图360度展示还可以接受，但是矩形不太适合。本文为了展示多种组合图形，采用OTU丰度大于0.5%的筛选阈值。
# 选择OTU表中丰度大于0.5%的OTU
filter_otus_from_otu_table.py --min_count_fraction 0.005 -i result/otu_table4.biom -o temp/otu_table_k5.biom
# 获得对应的fasta序列
filter_fasta.py -f result/rep_seqs.fa -o temp/rep_seqs_k5.fa -b temp/otu_table_k5.biom
# 统计序列数量，28条；30条以字比较大，容易看清标签
grep -c '>' temp/rep_seqs_k5.fa # 28
# clusto多序列比对
clustalo -i temp/rep_seqs_k5.fa -o temp/rep_seqs_k5_clus.fa --seqtype=DNA --full --force --threads=30
# 使用qiime的脚本调用fastree建树
make_phylogeny.py -i temp/rep_seqs_k5_clus.fa -o temp/rep_seqs_k5.tree
# 格式转换为R ggtree可用的树，之前加载报错，后来删除'符号后正常
sed "s/'//g" temp/rep_seqs_k5.tree > result/rep_seqs_k5.tree # remove '
# 获得序列ID
grep '>' temp/rep_seqs_k5_clus.fa|sed 's/>//g' > temp/rep_seqs_k5_clus.id
# 获得这些序列的物种注释，用于树上着色显示不同分类信息
awk 'BEGIN{OFS="\t";FS="\t"} NR==FNR {a[$1]=$0} NR>FNR {print a[$1]}' result/rep_seqs_tax_assignments.txt temp/rep_seqs_k5_clus.id|sed 's/; /\t/g'|cut -f 1-5 |sed 's/;/\t/g' |cut -f 1-5 > result/rep_seqs_k5.taxOTU按分类门级别上色
在Rstudio中，设置工作目录为下载测序数据的目录。有三种方法可选： Ctrl+Shift+H，或在Session菜单中选择，或使用setwd()命令设置工作目录。
# 运行环境R3.4.1，ggtree版本1.8.1
# 安装ggtree包，末安装者将FALSE改为TRUE即可
if (FALSE){
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite(c("ggtree"))
}
# 设置工作目录：选择 Session - Set working directory - To source file location,
# 我们的脚本ggtree.r位于测试数据文件夹根本目录，执行上面的操作可调置工作目录为脚本所在文件夹
rm(list=ls())
# 设置工作文件夹进入result，我们使用的大部分文件在此目录
setwd("result")
# 加载ggtree包
library("ggtree")
# 读入分析相关文件
# 读取树文件
tree <- read.tree("rep_seqs_k5.tree")
# 读取树物种注释信息
tax <- read.table("rep_seqs_k5.tax", row.names=1)
# 物种注释等级标签，共七级，但细菌末分类物种太多，一般只能在门、纲、目水平比较确定
colnames(tax) = c("kingdom","phylum","class","order")
# 按门水平建树并上色
## 给每个OTU按门分类分组，此处可以更改为其它分类级别，如纲、目等，即phylum替换为order或class即可
groupInfo <- split(row.names(tax), tax$phylum) # OTU and phylum for group
## 将分组信息添加到树中
tree <- groupOTU(tree, groupInfo)
# 画树，按组上色
ggtree(tree, aes(color=group))+ theme(legend.position = "right")+geom_tiplab(size=3)按门水着色的矩形进化树。我们可以看到我们基于V5-V7 rDNA区构建的树与分类学门水平相关性较好，如上面一大枝蓝色为Proteobacteria(变形菌门)，下面红色的一大枝为Actinobacteria(放线菌门)；也有一些异常结果，如最下面的蓝色变形菌门与黄色拟杆菌门聚在一起，导致分类与进化关系不一致原因很多，如V5-V7甚至rDNA并不能代表菌的真实分类、相同rDNA也可能有不同功能或新物种等原因。
画圈图
# 画圈图并保存PDF
pdf(file="ggtree_circle_color.pdf", width=9, height=5)
## tiplab2保证标签自动角度，默认无图例，要显示需要+theme
ggtree(tree, layout="fan", ladderize = FALSE, branch.length = "none",aes(color=group))+geom_tiplab2(size=3)+ theme(legend.position = "right")
dev.off()树+样品丰度热图
我们最常用的是高丰度、或差异OTU的树图，结合各样品的表达热图，来展示各样品间的重复性好坏、以及组间的差异。
# 树+丰度热图
# 思路：矩形树右端添加每个样品的表达丰度。
## 读取OTU表
otu_table = read.delim("otu_table.txt", row.names= 1, header=T, sep="\t")
## 读取实验设计
design = read.table("design.txt", header=T, row.names= 1, sep="\t")
## 取实验设计和OTU表中的交集:样本可能由于实验或测序量不足而舍弃掉，每次分析都要筛选数据
idx=intersect(rownames(design),colnames(otu_table))
sub_design=design[idx,]
## 按实验设计的样品顺序重排列
otu_table=otu_table[,idx]
## 将OTU表count转换为百分比
norm = t(t(otu_table)/colSums(otu_table,na=T)) * 100 # normalization to total 100
## 筛选树中OTU对应的数据
tax_per = norm[rownames(tax),]
## 保存树图于变量，align调置树OTU文字对齐，linesize设置虚线精细
p = ggtree(tree, aes(color=group))+ theme(legend.position = "right")+geom_tiplab(size=3, align=TRUE, linesize=.5)
p
pdf(file="ggtree_heat_sample.pdf", width=9, height=5)
## 添加数字矩阵
## offset设置两者间距，用于解决图重叠问题；width设置热图相对树图的宽度，解决热图和树图大小关系；font.size设置热图文字大小，解决文字过大重叠；colnames_angle调整热图标签角度，解决文字重叠问题；hjust调整热图标签位置，解决文字与热图重叠问题。
gheatmap(p, tax_per, offset = .15, width=3, font.size=3, colnames_angle=-45, hjust=-.1)
dev.off()现在我们看到了所有高丰度OTU的进化树，结合所有样品的相对丰度热图。树图为了让标签同时作为右侧热图的标签，采用了添加虚线左对齐的方式；热图展示样品中每个OTU的相对丰度百分比，我们可以看到各组内样品间的重复情况，也能看到各组间是否有差别，比如OTU_1在WT中整体偏高，而OTU_111却在WT中整体偏低。样品名为了显示全采用倾斜45度角，右侧还有门分类学、相对丰度百分比的图例。
树+组均值热图
# 树+ 组均值热图
## 有时样本过多也无法展示和阅读，需要求各组均值展示：需要将分组信息添加至样品相对丰度表，再分类汇总
## 提取实验设计中的分组信息
sampFile = as.data.frame(sub_design$genotype,row.names = row.names(sub_design))
colnames(sampFile)[1] = "group"
## OTU表转置，让样品名为行
mat_t = t(tax_per)
## 合并分组信息至丰度矩阵，并去除样品名列
mat_t2 = merge(sampFile, mat_t, by="row.names")[,-1]
## 按组求均值
mat_mean = aggregate(mat_t2[,-1], by=mat_t2[1], FUN=mean) # mean
## 去除非数据列并转置
mat_mean_final = do.call(rbind, mat_mean)[-1,]
## 重命名列名为组名
colnames(mat_mean_final) = mat_mean$group
## 按组均值热图
pdf(file="ggtree_heat_group.pdf", width=7, height=5)
gheatmap(p, mat_mean_final, offset = .05, width=1, font.size=3, hjust=-.1)
dev.off()按组显示，是不是清爽了许多。
更多绘图方法，可以直接阅读官方文档，链接见文末。
也推荐阅读Y叔自己写的一些博文，biobabble公众号文章目录，里面有26篇关于ggtree的文章，学习更多花样玩法。
Reference
ggtree官方文档 https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ggtree/inst/doc/ggtree.html
ggtree美化 https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ggtree/inst/doc/advanceTreeAnnotation.html
facet_plot: 关联数据和进化树的通用方法 http://mp.weixin.qq.com/s/FlrnY9GeV5fHa6EZpZhTJA
软件原文 G Yu, DK Smith, H Zhu, Y Guan, TTY Lam. ggtree: an R package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. **Methods in Ecology and Evolution*. doi:10.1111/2041-210X.12628.
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