浅聊多样性测序样本重复问题
本文转载自“基迪奥生物”，已获授权。
在16S等多样性测序领域中，大家问得较多的问题是：每个分组在没有重复情况下，是否可以做多组（或者两组）间差异分析？今天我们从分析原理、生物学意义以及性价比三个角度对这问题进行说明。
1. 分析原理
多样性测序中的差异分析所针对的“目标”有很多，无论从OTU、alpha多样性指数（如香浓指数）、样本间距离差异（如unifrac）、各水平物种分类（如属级别物种）都可以做组间差异分析。组间差异检验方法也是有多种类型，简单来说，包括有参和无参两种检验方法。有参检验方法如t检验、方差分析等，无参方法常用的有秩和检验。
无论是t检验还是方差分析，都需要算组内均值与方差，这在没有组内重复的情况下，难以实现（或非常没有统计意义）。而秩和检验，临界值表格都是从至少2个重复开始才有数值，也就是单分组至少2个重复才有统计意义。
但实际上，多种数据表明，秩和检验每组至少5个重复（如wilcoxon秩和检验，图1），才有可靠的统计学意义。至于我们常看到的Lefse、metastats、Anosim、Adonis等检验方法，本质也就是上面所提及的t检验等检验方法的衍生，因此也是符合以上的重复性要求的。
可能会有人提出来，有一些检验方法，例如转录组中的卡方检验，可以进行无重复之间的组间比较，那是否就表示可以进行这类型分析。其实答案是否定的。因为它本质考虑的问题不是生物学重复，而是技术重复，因此不在我们的讨论范围当中。
图1. 显著性0.01水平下的Wilcoxon秩和检验临界表
2. 生物学意义
转录组测序研究中，由于生物体稳定性以及实验条件的可控性（例如人为设定的用药剂量），因此组内样本的重复性极高，离散程度很低。这就是为什么转录组分析中的PCA等聚类效果好的原因。
群落微生物所处的环境一般都是客观环境，如宿主个体环境（例如肠道微生物）或者物化环境（如土壤微生物）等。这些环境影响因素比较复杂，如土壤微生物可同时受光照、肥料、雨水、温度、土壤PH等多个因素影响，而且每个因素对样本的影响程度并不可控，因此群落中物种的组成以及丰度极其不稳定，组内样本离散程度较大。一般2、3个样本都难以有很理想的重复效果，所以如果只是单纯的1个样本代表一个分组去进行差异比较，结果极其不可靠。
3. 性价比
可能会有人问，既然1个重复不可以做差异分析，那后续增加样本然后进行前后两批样本的合并分析是否可以。理论上来说，是可以的，但这是没办法的办法，也是一个不合理的办法。
试想，刚才所说的样本类型的分析当中，不同时间的采样，不同批次的测序数据，很有可能由于技术问题造成数据重复性过低。而且，就算技术重复没有问题，另外一个需要重点考虑就是周期问题，现在随便一个测序公司的测序周期都是少则2个月，多则3个月甚至更多，这会造成时间的极大浪费。
那么，需要设计多少重复？
既然每组一个重复并不合理，那是否3个重复就可以？从统计学来说，3个重复确实可以开展不少差异分析，但实际上，3个重复的样本，无论从实际操作还是统计意义上，都存在极大问题。关于多少重复、为什么要这么设计重复等问题，我们会在下一期的内容中为大家解答。
猜你喜欢
写在后面
为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外七十多位PI，七百多名一线科研人员加入。参与讨论，获得专业指导、问题解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职务”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。
学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”