土壤细菌定量方法结合相对丰度分析揭示种群的真实变化

本文转载自“微生态笔记”，己获授权。

前言：

微生物几乎存在于所有的环境中，在生物地球化学循环中扮演着至关重要的角色。特别是在土壤中，具有高度分类学多样性和代谢潜力的微生物群落，可以作为反映主要生态过程的一个重要的生物指标。因此，要衡量一些关键种群的数量，对于理解微生物群落在土壤中的贡献是相当重要的。然而，获取关键物种的准确密度不是一件容易的事。通常，捕捉个体是一种有效的对宏观社区调查的有效方式，但将微生物群落中所有个体都准确识别几乎是不可能的事情。随着高通量分子技术的快速发展，如IlluminaMiSeq/HiSeq测序，获取微生物群落组成的相对丰度变得更容易实现。然而，由于相对丰度只是作为占总样本部分的一个比例，所以这些估计值的可靠性不足以反映物种丰度的真实情况。因此，本研究将高通量测序得到的相对丰度，与多种绝对定量方法得到的绝对生物量相结合，定义为“估算的绝对丰度(EEA)”，能够更真实的反映不同取样点中土壤微生物群落的物种分布。

文章简介：

了解土壤生态系统中关键细菌类群的丰度变化，对土壤微生物学研究具有重要的意义。然而，通过高通量技术所观测到的特定类群的相对丰度差异不能够准确地反映其实际丰度情况。本研究探讨了土壤微生物相对丰度分析与微生物定量方法相耦合，在描述不同地区的微生物种群分布情况下，能提供更丰富的信息。我们利用16S rRNA高通量测序技术分析了北京和西藏草甸土的土壤微生物群落中主要类群的相对丰度，同时利用了五种微生物定量方法对土壤中细菌数量进行直接或间接定量。本研究所涉及的定量方法，包括三磷酸腺苷 (ATP)、流式细胞计数 (FCM)、定量PCR (qPCR)、磷脂脂肪酸 (PLFA) 以及微生物量碳定量 (MBC) 分析。通过对两个样地土壤微生物群落中主要类群的相对丰度和估算绝对丰度 (EAA) 的比较，发现几种主要类群表现出明显不同的差异性，包括Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Gemmatimonates以及Planctomycetes等。这些结果表明，EAA的变化能够为群落种群的动态方面提供了更多的信息。在微生物群落的研究中，物种的相对丰度不足以准确地计算出它们的绝对丰度，因此对细菌绝对丰度的定量分析对于微生物群落的综合分析是至关重要的。

方法介绍：

1. 采样点以及样品相对丰度分析

本研究采集了位于西藏高原(29^o36'21'N，85^o45'09'E)和北京松山 (42^o31'10'N，115^o49'32'E)的草甸土壤。每个样地采集10个土壤样本作为重复样。利用FastDNA^®SPIN试剂盒 (MP-Biomedicals) 提取20个土壤样本的DNA，针对16SrRNA的V4区采用515F和806R引物进行PCR扩增，扩增产物在中南大学的IlluminaMesiq测序平台进行测序。获得原始数据利用本地的Galaxy分析平台(http://mem.rcees.ac.cn:8080)进行分析，以获得土壤微生物群落优势类群的相对丰度。

我们将通过高通量测序分析得到的土壤优势类群的相对丰度与细菌的绝对定量结果相乘，定义为估算绝对丰度(EAA)。下面介绍本研究中所涉及的细菌定量方法。

2. 土壤样本预处理

在进行ATP和FCM分析前，需要对土壤样品中细菌进行分离。细胞提取方法参考Bressan等人的研究(Bressan et al.,2015)。将5g土壤样本在45 mL 0.85%的生理盐水(0.22 μm过滤后使用) 中稀释，快速涡旋5min。然后将悬浮液在130 × g条件下离心5min，去除较大的土壤颗粒。最后将上清液通过细胞过滤网 (40μm;BD FALCON) 过滤后得到各样本的菌悬液，为下一步做准备。

3. 三磷酸腺苷(ATP) 分析

采用GloMax20/20 (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA) 发光仪和BacTiter-Glo^TM(G8231, Promega Corporation, Dübendorf,CH) 试剂盒。本研究采用优化后的检测方法 (Hammes etal., 2010) 进行样品测定，具体方法如下：优化的ATP检测方法。分别取2mL用无菌超纯水 (Milli-Q) 稀释的不同浓度梯度(10^-2-10⁴ nM) 的ATP标准溶液(10mM; Promega Corporation) 和50μL ATP提取剂，在38 ^oC下加热至少1min；取500 μL ATP标准溶液加入50μL ATP提取剂中，加热20 s后立即取出测发光度。所有检测都重复3次取平均值。以ATP浓度为横坐标，生物发光强度(RLU) 为纵坐标，绘制标准曲线(R² > 0.99)。以同样的方法，检测经过各样本菌悬液的ATP浓度。最后，利用换算因子，估算各样本中的细菌个数。所有ATP检测均有3个重复，并且所有操作都在无菌条件下进行。

4. 流式细胞测定法(FCM)

由于土壤悬浮液中微生物数量极高，流式细胞仪(FCM，BD FACSCalibur，USA)，发射波长488nm，其限行范围为2×10²~1×10⁵个/mL，因此每个样本在检测前需要先稀释10,000倍，然后分别取1mL10 μL荧光染料SYBR Green I (100 ×DMSO， Invitrogen，USA)，37^oC避光孵育15min，用于后续检测。为了检测样本中所有的细菌数量，我们取500μL已染色的土壤悬浮液加入到BD绝对计数管(BD Biosciences) 中，涡旋混匀后，利用FCM进行检测。最终通过BD绝对数管的使用说明，换算成每克干土所含的细菌个数。

5. 定量PCR(qPCR)

以高通量测序所用的土壤样品DNA作为模版，进行qPCR，利用Qubit^®3.0荧光计检测DNA浓度。qPCR反应体系(20 μL) 包含10ng模版DNA，10μL SuperReal PreMix Plus (SYBR Green, TIANGEN, FP205)，以及前后引物(10 μM; Forward: 5’ -CCTACGGGAGGCAGCAG- 3’; Reverse:5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC- 3’) 各1.5μL。qPCR反应在CFXConnect^TM Real-Time PCR检测系统(BioRad) 进行，每个样本有3个重复。所有结果利用ΔCt的方法进行标准化后，用来计算16SrRNA拷贝数

6. 磷脂脂肪酸(PLFA) 分析

采用改良的Bligh-Dyer方法进行脂肪酸提取(Brant et al.,2006)。2g新鲜的土壤样品，加入甲醇-氯仿-磷酸缓冲液(2:1:0.8) 混合溶液进行萃取。土壤提取液进行过滤后，收集氯仿阶段。磷脂通过硅酸色谱从糖脂和中性脂质中分离，随后皂化与甲基化后转化为脂肪酸甲酯(FAME)。随后，FAME在毛细管气相色谱中分离，并利用气相色谱/质谱联用进行鉴定。所有的PLFA操作均在中国科学院南京土壤研究所进行。最终共有109种不同的PLFA被检测和识别。特定的PLFA(15:0, i16:0, 17:0, i15:0, a15:0, i17:0, a17:0, cy17:0, 16: 1w5, 16: lw7t,16:lw9, 18:lw7, and cy19:0)，通常作为细菌的生物标记。通过将所有细菌PLFA生物标记物的绝对含量进行加和，计算土壤中细菌的绝对生物量。我们利用换算系数来估算土壤细菌的个体数量。

7. 微生物量碳(MBC) 分析

取4^oC保藏鲜土约15g，在避光条件下，利用氯仿熏蒸24 h。按照水土比4:1配比，采用60mL的K₂SO₄溶液浸提熏蒸后土壤中的微生物量碳。稀释10倍后，利用MultiNC3100TOC测定仪进行检测。所有的MBCA操作均在中国科学院沈阳应用生态研究所进行。

结果与讨论：

1. 不同方法的细菌定量结果比较

不同方法用于土壤样品中细菌定量的结果，具有不同的单位，通常无法进行比较。我们通过参考文献，选用不同的换算因子，将不同方法的定量结果全部换算为每克干土中所含细菌的细胞个数或16S拷贝数(表1)。热图可视化的比较结果如图1所示，可以看出，ATP、FCM、qPCR以及PLFA的定量结果表现出较为一致的变化，而MBC的结果却是相反的。

表1  不同方法对土壤样品中细菌的绝对定量结果比较

图1  不同方法的定量结果比较 

我们将不同样地的定量结果进行比较可以看出，ATP、FCM、qPCR以及PLFA，这四种方法的结果均是，北京草甸土的微生物量显著高于西藏草甸土，然而MBC的结果确实西藏显著高于北京(图2)。  

图2  不同定量法对北京与西藏

草甸土微生物定量结果的比较 

我们将这几种方法的定量结果，进行Pearson相关性分析，发现ATP、FCM、qPCR以及PLFA，这四种方法之间均有着显著的相关关系，而与MBC却没有任何相关关系(表2)。此外，将定量结果与环境因子，包括含水率与总碳含量，进行相关性分析，发现ATP、FCM、qPCR以及PLFA，这四种方法之间均有着显著的相关关系，而与MBC却没有任何相关关系(表2)。以上结果，均表明，MBC定量法并不适用于我们的研究，后续分析比较将去掉这一方法。

表2  不同定量方法的Pearson相关性分析(**: P < 0.01) 

2. 北京与西藏草甸土中优势物种的相对丰度分析

北京与西藏两个样地的所有土壤样本，共得到了1,118,928条序列，最终以24,931条序列作为最小的序列数对20个样本进行标准化重抽。物种注释信息以50%的可信度并基于RDP分类数据库进行标注。

降趋势对应分析(DCA) 表明北京与西藏草甸土壤中的微生物群落结构具有显著差异。我们进一步分析了两个样地的土壤微生物群落组成，共有46个细菌门类被检测到，其中9个门在两个样地的相对丰度均达到90%以上，如图3A所示。我们利用三种非参数多变量置换分析方法，包括多元相应置换过程(MRPP), 相似度分析(ANOSIM)，以及对Adonis函数的多元方差分析(PERMANOVA)，均发现两个样地中土壤微生物群落在总体以及各组成上的差异性显著(P < 0.05)。变形菌门Proteobacteria与放线菌门Actinobacteria，在北京与西藏土壤中都是丰度最高的两个细菌门类，其他的7种分别为Acidobacteria，Bacteroidetes，Verrucomicrobia，Planctomycetes，Chloroflexi，Gemmatimonadetes，以及Cyanobacteria(图3A)。

图3 北京与西藏草甸土壤微生物在门水平上的

相对丰度分布 (A) 以及估算的绝对丰度分布(B) 

3.北京与西藏草甸土中优势物种的估算绝对丰度(EAA)

在本研究中，我们把估计的绝对丰度(Estimated absolute abundance，EAA)定义为一个相应的相对丰度与总的绝对微生物细胞数相乘的结果。该分类单元的相对丰度是从16SrRNA测序分析中获得的，而绝对的微生物细胞数则通过先前提到的测量值来量化。由此，我们将北京与西藏草甸土壤微生物的相对丰度与细胞个数绝对定量结果相结合，得到的结果如图3B所示，我们以ATP定量结果为例。很显然，由于西藏土壤生物量显著低于北京土壤，结合相对丰度之后，群落各组成的EAA发生了明显的变化。

为了将两个样地中土壤微生物群落的相对丰度与估算绝对丰度(EAA) 的变化进行可视化，我们利用响应比来表示，如图4所示。带有95%置信区间的响应比分析表明，在北京与西藏草甸土壤中占据丰度较高的微生物，其相对丰度与估算绝对丰度(EAA) 的结果差异并不大，如变形菌门Proteobacteria的相对丰度与EAA均表现出在北京显著高于西藏。然而，有一些物种发生了显著的变化，如红框中的微生物门类，其中Actinobacteria，Bacteroidetes，Chloroflexi以及Gemmatimonates等门类的相对丰度，在北京与西藏土壤中并没有显著差别，然而结合绝对定量结果后，其EAA表现出在北京显著高于西藏；而另外一些门类，如Verrucomicrobia和Planctomycetes，其相对丰度在北京显著高于西藏，而EAA则无明显差别。

图4    北京与西藏草甸土壤微生物群落中主要

细菌门类的相对丰度与估算绝对丰度 (EAA) 的

响应比。显著性在响应比的95%置信区间上进行

计算的。当95%置信区间没有覆盖0，则表示结果

显著，反之，则不显著。当响应比大于0时表示该

物种的丰度在北京土壤中高于西藏，反之亦然。 

4. 估计绝对丰度(EAA)与相对丰度和定量检测之间关系的概念模型

由于相对丰度的差异可能不适合解释自然条件下微生物群落的丰度差异，因此我们提出了一个将相对丰度与定量结果相结合得到估算绝对定量的概念模型，如图5所示。假设有两个群落(均有5个颜色，每种颜色代表一个物种)，群落1中共有N个个体，群落2中共有M个个体，其中M大约为N的二倍。同时，我们对5个颜色的个体在两个群落中的相对丰度进行计算。结合绝对定量后，得到估算的绝对丰度EAA，并与相对丰度进行比较。可以发现，图五中红色的相对丰度在群落2中低于群落1，但是其EAA在群落2中比群落1中高。 

图5 解析估计绝对丰度(EAA)与相对

丰度和定量检测之间关系的概念模型

依据我们所提出的概念模型(图5)显示，当相对丰度分析的同时进行绝对定量，不同类群的EEA可能会发生显著的变化。任何一种分类的丰度变化都可以用两种方式来解释：(1)其绝对丰度的改变会明显导致相对丰度发生相应变化；(2)一个类群的相对丰度变化可能是由于群落中其他分类单元的绝对数量的变化所驱动的，而该类群本身的绝对数量并没有变化。Fang等人的研究表明，气候变暖会显著地改变土壤微生物群落的组成，然而对土壤微生物的总生物量并没有显著影响(Fang et al., 2016)。在许多生态过程中，环境条件的变化对当地和区域尺度上同类物种的相对丰度影响不大，而诸如土壤质量等，只会取决于土壤微生物的总量。有研究表明，微生物数量应对环境变化的响应比较敏感，例如重金属压力下微生物总量会降低，施加营养物质会增加，然而微生物类群的相对丰度则表现出明显不同的变化。Berga等人证明，增加扰动强度，并没有直接使活性细菌群落的组成发生明显变化，而细菌的绝对丰度却发生显著下降(Berga et al., 2012)。其原因可能是微生物群落中物种的丰度变化速率与环境扰动所引起的微生物数量的变化速率有着明显差异，导致我们观测到的一些物种在环境扰动下相对丰度增加，而另一些物种则在施加营养时相对丰度反而下降。因此，研究生态过程中关键微生物类群的相对与绝对丰度变化，是很有必要的。

结论：

无论是研究不同群落组成简单差异，还是针对群落演替中各组成的变化规律，仅仅关注其相对丰度是不够的，可能会忽略掉关键物种的实际丰度变化。而这种实际丰度能够为我们的研究带来更多的重要信息，因此结合生物量的绝对定量，来估算绝对定量，是非常有意义的。不同的微生物定量方法，ATP、FCM、qPCR以及PLFA，其结果表现出较好的一致性。但是各有优缺点，需要针对不同的环境样本以及研究目标，来确定定量方法的选择。

论文链接（点击查看原文）：

https://www.nature.com/articles/s41598-017-05260-w

参考文献：

1. Berga, M.,Szekely, A. J. & Langenheder, S. Effects of Disturbance Intensity andFrequency on Bacterial Community Composition and Function. Plos One 7 (2012).

2. Brant, J. B.,Sulzman, E. W. & Myrold, D. D. Microbial community utilization of addedcarbon substrates in response to long-term carbon input manipulation. Soil Biol Biochem 38, 2219-2232 (2006).

3. Bressan, M. et al. A rapid flow cytometry method toassess bacterial abundance in agricultural soil. Appl Soil Ecol 88, 60-68(2015).

4. Fang, X. et al. Warming effects on biomass andcomposition of microbial communities and enzyme activities within soilaggregates in subtropical forest. BiolFert Soils 52, 353-365 (2016).

5. Hammes, F.,Goldschmidt, F., Vital, M., Wang, Y. Y. & Egli, T. Measurement andinterpretation of microbial adenosine tri-phosphate (ATP) in aquaticenvironments. Water Res 44, 3915-3923 (2010).

6. Zhang Z, Qu Y, Li S, Feng K, Wang S, Cai W et al. (2017). Soil bacterialquantification approaches coupling with relative abundances reflecting thechanges of taxa. Sci Rep 7, 4837.

中国科学院生态环境研究中心

环境生物技术重点实验室

邓晔 研究员课题组发布

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