干细胞治疗17例类风湿性关节炎患者的临床疗效观察

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症性免疫性疾病，以血管炎和滑膜炎为基本病理特征，随着病情的发展，继而以滑膜增殖和赘生、关节软骨及软骨下骨侵蚀为主要病理改变，最终导致关节强直畸形和功能丧失；目前认为自身抗原介导的超敏反应以及非抗原特异性炎症反应是导致破坏性病变的主要原因。

对于RA的治疗，传统主要使用非甾体类抗炎药物(NSADs)和慢作用抗风湿药(SAARDs)，但病情复发率高，副作用很明显，而且不能改变病情的进展；近年来发展的针对细胞因子靶向治疗的生物治疗方法，但生物制剂的使用容易增加各种手术后感染的发生，且对损伤的关节无明显的修复能力，从而限制了其在临床上的使用。

由于间充质干细胞具有再生修复实质组织器官和免疫调节的生物学特性，我们探索应用脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal stem cell, UC-MSC)对17例RA患者进行治疗，配合小剂量药物及康复锻炼，取得了良好疗效。

1、材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 病历资料自2008年8月至2009年11月我科采用UC-MSC治疗的17例RA患者，男4例，女13例；年龄11～72岁；病程3年～20年；长期使用NSADs、SAARDs及激素等药物治疗，病情控制不佳。其中2例合并强直性脊柱炎(AS)，1例幼年类风湿(JRA)。

17例患者均有不同程度的多关节疼痛，疼痛关节数>3个，晨僵>3小时，28个关节的疾病活动度评分(DAS28)>3.2，伴有多个指间和指掌关节肿胀，3例患者伴有下颌关节肿痛，4例患者伴有膝关节肿胀，5例患者伴有指关节畸形，呈尺偏和/或“鹅颈”样改变；14例患者ESR在20～40mm/h之间，2例在40～60mm/h之间，1例ESR>100mm/h；13例患者CRP在10～30mg/L之间，4例在30～60mg/L之间。

14例患者类风湿因子阳性，检测ANA谱中8例患者Ro-52抗体阳性(+～+++)、抗CCP抗体阳性(+～+++)，10例患者手X线片示指关节间隙变窄，4例患者胸片提示有不同程度的肺间质增生；2例类风湿合并AS患者，伴有脊背部、髋关节疼痛，不能自行翻身、起床、穿鞋袜，此两例强直性脊柱炎疾病活动性指数(BASDAI)分别为2.7、3.6，血清检查HLA-B27阳性。

骶髂关节CT片均有模糊、边缘不清的改变，X线均提示有胸、腰椎钙化并呈竹节样改变；16例患者符合1987年美国风湿病协会提出的诊断标准。1例JRA患者，伴有反复出现发热、皮疹，对称性多关节疼痛以大关节为主，类风湿因子阳性，抗CCP抗体阳性，抗U1-nRNP抗体++，符合1989年美国风湿病学会幼年型类风湿性关节炎诊断标准。

1.1.2诊断标准 1987年美国风湿病学会(ARA)修订的诊断标准：①晨僵至少1小时(≥6周)；②腕掌指关节或近端指间关节肿(≥6周)；③3个或者3个以上关节肿(≥6周)；④对称性关节肿(≥6周)；⑤皮下类风湿结节；⑥手线变化；⑦类风湿因子阳性；具有其中四项即可诊断。

1.2 脐带间充质干细胞制备 UC-MSC制备过程简述如下：采集新生儿脐带，将脐带剪碎至约1mm×1mm×1mm，经0.1%胶原酶和0.125%的胰酶37℃分别消化30分钟，先后用100目及200目滤网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞按1×10⁶/cm²接种于塑料培养瓶,用含DMEM-LG/F12(Sigma, USA)，5%FCS(Gibco BRL, USA)的培养基，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养，4～5天后换液，弃非贴壁细胞，以后每3～4天半量换液。

待细胞80%融合，0.25%胰酶(Sigma, USA)消化，按1×10⁴/cm²传代。贴壁细胞常规消化后，以FITC标记的CD105(SH2)、CD44抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪(FACA Calibur型，USA)检测。获得(1.0～5.6)×10⁷的UC-MSC，流式细胞仪检测阳性率为95%。

1.3 治疗方法 17例患者均直接将细胞数为1×10⁷的UC-MSC 30mL静脉输注，除1例RA患者因病情反复予以2次治疗外，其余16例患者均给予1次治疗；2例RA合并AS患者，在静脉输注同时，将部分UC-MSC用生理盐水按1：4比例稀释，沿脊柱两侧竖脊肌及骶髂关节区域点状注射。

1.4 疗效标准

1.4.1  按RA临床缓解标准(ARA标准) 临床缓解：晨僵时间小于15分钟，无乏力感，无关节疼痛及压痛，无关节肿胀，血沉女性少于30mm/h、男性少于20mm/h。以上5项至少达到4项者；显效：晨僵、关节痛及压痛、关节肿胀、血沉和CRP各项进步50%，RF下降30%以上，以上6项达到4项者；有效：符合显效标准6项中3项者；无效：达不到显效标准6项中3项者或病情恶化者。

1.4.2  28个关节的疾病活动度评分(DAS28) 检查双侧近端指间关节、掌指关节、腕关节、肘关节、肩关节及膝关节共计28个关节，得出关节触痛数(T28)和肿胀关节数(SW28)，采用以下公式计算：DAS28=[0.56×+0.28×+0.70×Ln(ESR)] ×1.08+0.16。DAS28≤2.6分提示病情处于缓解期；2.6～3.2分之间提示病情处于低活动度；3.2～5.1分之间提示病情为中活动度；>5.1分提示病情为高活动度。

1.5安全性评估每次随访记录患者的不良反应，定期检查血常规、尿常规、肝肾功能、血清免疫球蛋白、C3、C4、心电图、X线胸片、血压等指标以观察其不良反应及其转归情况。不适反应分级为：0无不适；1轻度不适，未影响日常生活；2中度不适，影响日常生活和工作；3中度不适，明显影响生活，卧床休息；4重度不适，危及生命。

2、结果

2.1 有效性评估17例患者，随访4月～14月，中位随访期为11个月，全部患者在饮食、睡眠、体力、疲劳等方面均有明显改善；按美国风湿病协会(ARA)制定的类风湿性关节炎疗效评估标准，全部患者满足ARA20标准，多关节疼痛、肿胀、压痛明显缓解，疼痛、肿胀的关节数减少，关节活动度增加，晨僵<1小时；15例患者DAS28<3.2，其中12例患者满足ARA70标准，DAS28<2.6，多关节疼痛、肿胀、晨僵及压痛消失；1例患者DAS28在3.2～5.1分之间，1例DAS28>5.1分；

按DAS28评分标准，70.6%的患者缓解，17.6%的患者处于低活动期。复查ESR，5例在20～40mm/h之间，12例正常；复查CRP，4例在10～30mg/L之间，13例正常。17例患者治疗前后CRP和DAS28均明显趋向正常或缓解，向理想分布区域(CRP<5mg/L，DAS28<2.6)接近，参见图1。复查患者手X线片无明显变化，4例肺间质增生的患者，2例肺间质增生较前减轻。

2例类风湿合并AS患者，BASDAI分别降为1.2、2.5，脊背部、髋关节疼痛缓解，能自行翻身、起床、穿鞋袜。16例患者病情无反复；1例JRA患者，UC-MSC治疗4天后发热、皮疹消退，多关节疼痛得到控制。1例患者在UC-MSC治疗5个月后，因“感冒”病情出现复发，再次UC-MSC治疗，症状缓解，现随访8个月，病情无反复。

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2.2 安全性评估患者均无不适症状。对17例患者治疗前后血常规、肝肾功的各项指标检测结果,及12例患者治疗前后血清免疫球蛋白及补体C3、C4检测结果,采用EXCEL中的TTEST软件进行t配对检验分析,无统计学意义(P>0.05),见表1、2、3。

3、讨论

类风湿性关节炎至今病机病理未明，采用NSADs、SAARDs及激素治疗RA已有数十年的历史，长期的随访和回顾发现，患者病情复发率高，NSADs和SAARDs的副作用很明显，长时间服用激素还引起患者免疫降低、骨质疏松、水钠储留，患者依从性差，而且不能改变病情的进展；RA除损伤关节外，还会累及多组织、器官，传统的药物治疗未涉及到再生、修复受损组织的问题。

近年来发展的针对细胞因子靶向治疗的生物治疗方法，如TNF-α竞争性抑制剂Etanercept和TNF-α单克隆抗体Infliximab广泛使用，抑制了滑膜细胞增生，减少炎症因子释放，达到了抗炎和改善RA病情的作用。

然而，Giles等研究发现，TNF-α抑制剂的使用容易增加各种手术后感染的发生，且对损伤的关节无明显的修复能力，从而限制了其在临床上的使用。随着组织细胞工程学和细胞生物学的发展，对干细胞的研究不断深入，应用干细胞治疗RA将成为热点。其中间充质干细胞具有再生修复实质组织器官和免疫调节的生物学特性，为RA的治疗提供了全新的前景。

目前对一些难治性RA，临床治疗极为棘手；部分患者对某类免疫抑制剂不能耐受，限制了药物的使用范围。因此，需要探索新的治疗手段。基于国内外对UC-MSC基础理论广泛、深入的研究，我们认识到UC-MSC治疗RA具有广阔前景。从理论上看，MSCs治疗RA具有以下优势：

①基础研究证实MSCs在体内外可以分化为成骨、软骨、脂肪、腱、肌肉等细胞，可能参与受损组织的再生修复；关节病变可以促进MSCs向病变滑膜聚集，从而修复损伤的关节组织。

Gao等报道了利用MSCs构建骨、软骨联合移植物的可行性，证实了在固体支撑物中加入MSCs可以促进缺损软骨的修复。使用原代鼠源MSCs腹腔注射关节炎模型小鼠，单次注射MSCs可预防骨和软骨严重的损伤。

②MSCs能分泌多种细胞因子，具有营养作用，能促进干细胞的增殖和分化。

③MSCs具有独特的免疫调节作用，自体或异体的MSCs加入到有丝分裂原刺激的外周血淋巴细胞培养体系中，均能明显抑制T淋巴细胞的增殖活化，对免疫网络的调节起重要的作用，有望从根本上调整患者病态免疫系统；此外，有学者发现即使MSCs分化成其他类型的细胞，也继续保留它的免疫调节作用。

④MSCs具有趋化作用，可以阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，减轻组织损伤，有利于阻止病情进展。

在取得17例患者及其家属同意后，我们对这些患者进行UC-MSC治疗。从我们目前治疗及随访的结果看，应用UC-MSC治疗RA，能迅速缓解患者症状，特别是对于关节肿疼及晨僵的缓解，尤为明显，本文中17例患者一般情况，如饮食、睡眠、疲劳等方面，也有明显改善。

这可能与UC-MSC分泌多种具有营养功能的细胞因子有关。从17例患者复查结果来看，70%患者ESR降至正常，76%患者CRP降至正常，UC-MSC治疗RA能显著降低患者的炎性指标，这可能和MSCs具有趋化作用、阻止炎性介质的释放有关。12例患者满足ARA70标准，DAS28<2.6，随访至今，病情平稳，治疗效果满意，这与干细胞及细胞因子之间的相互作用和对免疫网络的调整相关。

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从安全性评估来看，17例患者均无不良反应；治疗前后17例患者血常规、肝肾功的各项指标和12例患者血清免疫球蛋白及补体C3、C4检测结果无显著变化，表明脐带间充质干细胞治疗对人体各项指标无明显改变。因此，UC-MSC治疗RA，是安全可行的。影像学随访资料，尚需要进一步观察。

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