上海长征医院：32例试验数据证实，NK细胞输注可以抗衰老
最近，上海长征医院输血科、上海交通大学免疫研究所等单位合作在《Frontiers in Immunology》上发文，首次从数据层面证实了自体NK细胞输注能显著缓解T细胞衰老、衰竭，抑制关键成分SASP(衰老相关分泌表型）的有效方法，特别是针对免疫系统，衰老可以通过NK细胞输注让其向更年轻的方向发展。
方法：招募37名中年健康受试者，其中32人静脉注射扩增的NK细胞，5人静脉注射生理盐水。
然后，我们通过流式细胞术监测输注后 4 周内外周衰老和耗竭 T 细胞的变化，以及衰老相关分泌表型 (SASP) 相关因子的血清水平。进行体外共培养测定以研究 NK 介导的针对衰老或耗尽 T 细胞的细胞毒活性。最终表征了 NK 细胞在扩增前后的功能和表型变化。
结 果
基线特征
从 2017 年 7 月到 2018 年 9 月，共有 54 名年龄在 45 到 55 岁之间的受试者中有 47 名被招募到该研究中，因为据报道这些中年人群的 NK 细胞生物学受损 ( 29 , 30)。筛选时排除8名志愿者，其中3名检测指标不全，2名肝功能检测有2项以上异常，1名免疫指标异常，1名感染指标阳性，1名血液生化指标异常。因此，本研究招募了 39 名志愿者。他们接受了白细胞去除术和随后的 NK 细胞给药。然而，两名受试者在 NK 细胞给药后错过了样本采集，因此不得不退出研究。最终，有 37 名受试者成功完成了研究，其中男性 18 名，女性 19 名（图 1）).。
重要的是，所有志愿者在参与前都咨询并签署了知情同意书。同时，32 名志愿者重新注射了自体 NK 细胞，5 名志愿者注射了生理盐水。补充表 1中列出了受试者的基线特征和 NK 细胞信息。
自体NK细胞输注的安全性
NK细胞给药后，所有受试者的体温和血压均正常。没有人出现皮疹、局部感染和出血、发烧、发冷、呼吸困难、恶心和呕吐。然而，一名受试者在细胞输注后 1 周内出现了难眠症，此后恢复。一个人在细胞输注后1周内出现头晕，这种现象持续了2周才恢复。两名受试者出现疲劳，其中一名出现轻度疲劳，另一名出现疲劳，均在 2 周内恢复（补充表 2).。此外，我们在细胞输注后 1 个月进行了常规血液检查、血液学检查以及尿液和病毒学检查。根据ALT、AST、尿素和肌酐的正常血清水平，未观察到肝毒性和肾毒性。
NK 细胞输注后衰老 T 细胞减少
先前的研究已经证明，衰老细胞的积累会加速与衰老相关的疾病，而 p16 阳性细胞的清除会延缓这种现象 ( 31 )。NK 细胞在清除衰老细胞和抵御癌症的先天免疫中发挥着重要作用 ( 22 )。因此，进行流式细胞术分析以检测 CD4 + CD28 -、CD4 + CD57 +、CD4 + KLRG1 +、CD4 + CD28 - CD57 +和 CD4 + CD28 - KLRG1 +的群体作为衰老的 CD4 +基线时以及输注后 1 周和 4 周时的 T 细胞。
结果显示，在细胞输注后的两个时间点，CD4 +和 CD8 + T 细胞群没有显著变化（图 2A、B）。然而，衰老的 CD4 + T 细胞在 NK 细胞输注后 1 周和 4 周显著减少（图 2C）。此外，性别对 NK 细胞输注引起的衰老 CD4 + T 细胞减少没有影响（图 2D）。
正如我们所知，CD8 + T 细胞是主要的肿瘤杀伤细胞群 ( 32 )。CD8 +细胞毒性 T 细胞可以通过表达 FasL 和分泌颗粒酶 B 和 IFN-γ 来减弱肿瘤生长 ( 33 )。然而，衰老 T 细胞的积累会损害 T 细胞介导的反应。因此，我们检查了基线时以及输注后 1 周和 4 周时CD28 -、CD57 +、KLRG1 +、CD28 - CD57 +和 CD28 - KLRG1 +衰老 CD8 + T 细胞的百分比。我们发现衰老的 CD8 +在 NK 细胞输注后 1 周和 4 周，T 细胞显著减少（图 2E）。NK 细胞输注诱导的衰老 CD8 + T 细胞减少与性别无关（图 2F）。
NK 细胞输注后耗尽的 T 细胞减少
在慢性感染和癌症期间，记忆 T 细胞随着持续的抗原暴露和炎症而分化 ( 15 )。据报道，人类在病毒感染（例如 HIV 和丙型肝炎病毒 (HCV)）和癌症发展过程中会发生 T 细胞耗竭 ( 34 , 35 )。重要的是，耗竭的 T 细胞的特征是 PD-1、TIM-3、CTLA-4 的表达升高以及它们相关信号通路的激活。最近抗 PD-1/PD-L1 抗体在癌症免疫疗法中的成功应用证明了靶向 T 细胞耗竭的治疗的重要性和有效性 ( 36 )。然后，我们检测了 NK 细胞输注是否影响耗尽的 CD4 +和 CD8的百分比+ T 细胞。结果显示，CD4 + PD-1 + T 细胞、CD8 + PD-1 + T 细胞、CD4 + TIM-3 + T 细胞和 CD8 + TIM-3 + T 细胞在 NK 细胞输注后第 1 周显著减少和 4 周（图 3A）。
这些结果表明，NK 细胞输注可能通过缓解 T 细胞的衰竭状态来改善 T 细胞的功能。此外，在 NK 细胞输注后 1 周和 4 周， PD-1 +和 TIM-3 + T 细胞的减少与性别无关（图 3B）。
细胞类型影响 NK 细胞输注诱导的作用
在接受 NK 细胞的 32 名参与者中，14 名志愿者重新注射了从冷冻保存的 PBMC 中扩增的 NK 细胞，18 名志愿者重新注射了从新鲜 PBMC 中产生的 NK 细胞。我们想探讨 NK 细胞输注诱导的免疫系统改变是否取决于 NK 细胞的起始状态。我们通过单因素方差分析对这两组进行多重比较分析。
结果显示，在新鲜 NK 细胞输注组中， TIM3 +、KLRG1 +、CD28 - CD57 +和 CD28 - KLRG1 + T 细胞在 1 周或 4 周时显著减少（图 4A），而 CD28 -、 CD57 +, PD-1 + T 细胞与冷冻 NK 细胞输注相比，新鲜 NK 细胞输注组没有显著变化（图 4B）。
NK 细胞输注后关键 SASP 相关因素减少
衰老细胞随着衰老而积累并导致 SASP 相关因子的释放，包括促炎细胞因子（IL-1α、IL-17 和 IL-6）、趋化因子（IL-8）和蛋白酶（MMP-1、MMP -1α 和 MMP-1β）。这些 SASP 相关因子在与衰老相关的炎症、疾病和发病率中起着关键作用 ( 37 – 39 )。因此，为了检查 NK 细胞输注是否降低了 SASP 相关因子的系统水平，我们测量了 NK 细胞输注前后收集的血浆中的细胞因子水平。我们发现 NK 细胞输注后血浆中关键 SASP 相关因子的水平较低，包括 IL-6、IL-8、IL-1α、IL-17、MIP-1α、MIP-1β 和 MMP1，而 IFN- γ 是一种非 SASP 相关因子，并未持续显著改变（图 5).。
这些结果表明，NK 细胞输注可以减弱 SASP 相关因子的积累并提高 CD4 +和 CD8 + T 细胞的活性。
衰老T细胞和衰竭T细胞在对照组无明显变化
我们已经知道，在输注 NK 细胞后，衰老 T 细胞和衰竭 T 细胞的百分比显著下降。为了进一步验证 NK 细胞输注与 T 细胞减少之间的关系，我们获得了五名注射生理盐水的志愿者（补充表 1）。我们发现注射盐水后总 CD4 +和 CD8 + T 细胞百分比没有显著变化（图 6A）。PD-1+ 和 TIM3+ T 细胞等耗尽的 T 细胞百分比在注射生理盐水后没有减少，衰老的 T 细胞群如 CD28 - 、CD57 + 、KLRG1 + 、 CD28 - CD57 +也没有减少和 CD28 - KLRG1 + T 细胞（图 6B、C）。
最后，我们探索了更大队列中的数据，以评估这五名受试者实现衰老 T 细胞减少的能力（补充表 3）；以排除生理盐水也会引起衰老细胞变化的假说。
PostNK 细胞杀死衰老的 CD4 + T 细胞但不杀死正常的 CD4 + T 细胞。
最后，我们想知道 NK 细胞输注如何影响衰老 T 细胞的百分比。
先前的研究表明，NK 细胞可以杀死和清除衰老细胞以避免旁分泌作用。因此，我们首先在体外与自体postNK细胞共培养PBMC（补充图2 ），并检测CD28 -和CD28 + CD4 + T细胞的百分比。我们发现 CD4 + T 细胞的百分比在 postNK 细胞附着后增加。在导致 CD28 + CD4 + T 细胞略微增加的同时，postNK 细胞附着显著导致死亡 CD28 - CD4 +比例增加T 细胞（图 7A–C ），对死亡 CD4 + T 细胞的增加至关重要。
此外，我们在非放射性细胞毒性测定 (Pro-mega) 中使用 CD28 - CD57 + CD4 +或 CD28 + CD4 + T 细胞与自体 postNK 细胞（补充图 2 ）共培养，而不是总 PBMC。
结果表明，postNK 细胞附加以剂量依赖性方式特异性杀死 CD28 - CD57 + CD4 + T 细胞而非 CD28 + CD4 + T 细胞（图 7D）。当CD3 + PD1+ T 细胞与 preNK 或 postNK 共培养，E:T 细胞比例为 10:1，孵育 20 小时后未检测到 LDH 活性（数据未显示）。此外，NK 细胞加入对衰竭 T 细胞上的 PD1 表达几乎没有影响（图 7E、F）。postNK 细胞显示出对 K562 和穿孔素分泌的显著改善的细胞毒性（图 7G、H）。然而，通过 ELISA，仅在供体 1 的前 NK 细胞与 K562 的共培养样品中检测到 IFNγ，平均浓度为 412.5 pg/ml。
preNK 和 postNK 细胞的表型特征
为了更好地理解为什么输注扩增的 NK 细胞显示出 T 衰老和衰竭的显著改善，我们进一步比较了体外扩增程序后 NK 细胞的表型变异（图 8A-C）。两个个体的 preNK 细胞主要表达 NKG2C、KLRG1 和 CD57，同时具有低得多的 NKG2A 水平。LAG3 在 preNK 和 postNK 细胞中几乎不表达。扩增程序后，postNK 细胞的 NKG2C、CD57 和 KLRG1 表达较低，但 NKG2A 和 TIM3 表达较高。此外，不同个体的 postNK 细胞显示出比其 preNK 对应物更相似的指示受体表达模式。
结 论
总之，本研究最初揭示了 NK 细胞输注对中年健康个体 T 细胞功能障碍和细胞衰老的影响。我们的研究结果表明，自体 NK 细胞给药是显著缓解 T 细胞衰老和衰竭以及 SASP 关键成分的有效方法。postNK 细胞表现出更高的细胞毒活性，可以特异性地直接识别和清除衰老的 T 细胞。此外，在体外观察到激活和抑制受体（包括 NKG2C、NKG2A、KLRG1、LAG3、CD57 和 TIM3）的不同表达模式扩展过程，可能有助于它们的功能改变。
我们的数据重要地表明，至少对于免疫系统而言，衰老可以通过自体 NK 细胞的转移向更年轻的方向操纵。进一步探索应关注自体NK细胞影响T细胞衰老和衰竭的分子机制。此外，进一步研究这些衰老和衰竭的 T 细胞群、它们的起源以及它们在免疫病理条件下的功能将极大地促进 NK 免疫疗法的临床应用。
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