空间转录组第五讲：10x spaceranger aggr合并多个样本

10x空间转录组数据跑完Space Ranger之后都会生成单个样本的cloupe.cloupe文件，这个文件可以用Loupe Browser来对单个样本进行可视化，Loupe Browser操作简单、结果直观，非常适合不太会写代码的老师或同学来自己挖掘数据。但是，做过单细胞或空间转录组项目的同学应该都知道，实际上做数据分析的时候是需要多个样本合并起来分析的，如果再用单个样本进行可视化就不太合适了，所以我们需要把多个样本的cloupe.cloupe整合成一个合并的cloupe文件，这样就方便自己用Loupe Browser来有效的挖掘有价值的信息。

    这里我们来介绍一下，怎么用10x spaceranger aggr来合并多个空间转录组测序的样本数据。

     第一步

确保单个样本的spaceranger count已经跑完了，假如我们前面运行spaceranger count时生成了三个文件：

$ spaceranger count --id=LV123 ...
... wait for pipeline to finish ...
$ spaceranger count --id=LB456 ...
... wait for pipeline to finish ...
$ spaceranger count --id=LP789 ...
... wait for pipeline to finish ...

第二步

准备样本信息的csv文件，内容格式如下（注意逗号分隔）。

列信息说明：

library_id:样本id

molecule_h5:运行spaceranger count生成的molecule_info.h5文件路径

cloupe_file:运行 spacerangercount生成的cloupe.cloupe文件路径

spatial_folder：运行 spaceranger count生成的spatial文件夹路径

  除了上面指定的4列之外，也可以加入其它分类信息的列，最后会在Loupe Browser可视化的时候当成一个分组方式来展示。比如下面，增加一列样本分组信息，不过注意这里因为宽度的原因把spatial_folder列省略掉了，实际上spatial_folder这一列还是有的。

另外需要注意，spaceranger aggr是不进行批次校准的，所以不同的染色方法的组织是不能合并到一起的（例如免疫荧光和H＆E染色的组织切片）。

第三步

运行spaceranger aggr：

$ spaceranger aggr --id=AGG123 \
                  --csv=AGG123_libraries.csv \
                  --normalize=mapped

参数说明：

--id：输出文件的id

--csv：样本信息csv文件

--normalize：depth归一化的方法，默认是mapped，也可以选none。

结果输出：

成功运行后会到的下面的信息（包括主要的输出文件）

2018-10-04 13:36:33 [runtime] (run:local)       ID.AGG123.SPATIAL_RNA_AGGREGATOR_CS.SPATIAL_RNA_AGGREGATOR.SUMMARIZE_AGGREGATED_REPORTS.fork0.join
2018-10-04 13:36:36 [runtime] (join_complete)   ID.AGG123.SPATIAL_RNA_AGGREGATOR_CS.SPATIAL_RNA_AGGREGATOR.SUMMARIZE_AGGREGATED_REPORTS
2018-10-04 13:36:45 [runtime] VDR killed 210 files, 29MB.
 
Outputs:
- Aggregation metrics summary HTML:                           /home/jdoe/runs/AGG123/outs/web_summary.html
- Aggregation metrics summary JSON:                           /home/jdoe/runs/AGG123/outs/summary.json
- Secondary analysis output CSV:                              /home/jdoe/runs/AGG123/outs/analysis
- Filtered feature-barcode matrices MEX:                      /home/jdoe/runs/AGG123/outs/filtered_feature_bc_matrix
- Filtered feature-barcode matrices HDF5:                     /home/jdoe/runs/AGG123/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
- Unfiltered feature-barcode matrices MEX:                    /home/jdoe/runs/AGG123/outs/raw_feature_bc_matrix
- Unfiltered feature-barcode matrices HDF5:                   /home/jdoe/runs/AGG123/outs/raw_feature_bc_matrix.h5
- Copy of the input aggregation CSV:                          /home/jdoe/runs/AGG123/outs/aggregation.csv
- Loupe Browser file:                                         /home/jdoe/runs/AGG123/outs/cloupe.cloupe
- Aggregated tissue positions list:                           /home/jdoe/runs/AGG123/outs/aggr_tissue_positions_list.csv
- Spatial folder containing spatial images and scalefactors:  /home/jdoe/runs/AGG123/outs/spatial
 
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