Neuron︱光遗传技术突破！PPO可实现快速且可逆的神经元光遗传抑制操作

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撰文︱唐家辉

责编︱王思珍

光遗传学（optogenetics），是一项整合了光学、遗传学、电生理学、以及软件控制等多学科交叉的生物技术【1】。作为一种神经调节技术，其原理，简言之，即借助基因操作技术，将能够对光起响应的离子通道（蛋白）或基因工程G蛋白偶联受体（GPCRs）表达在特定细胞中，实现通过光来特异性地激活（兴奋）或抑制（沉默）特定神经元，进而来研究特定神经活动【2-3】。实际应用中，利用光遗传学激活神经元活动领域取得了显著进展，然而实现快速并可逆的神经元抑制则相对困难很多。

相比较于光遗传激活神经元，以光敏感通道蛋白来抑制神经元（即光遗传抑制神经元）的可操作性低，缺乏空间和时间的准确性。opto-XR，一种光敏感视觉蛋白视紫红质（rhodopsin）与GPCRs的嵌合体，通过将不同的GPCRs剪接到视紫红质上，赋予GPCRs光敏性，实现对生理信号级联的时空控制【4】。然而，由于视紫红质生色团的高光敏性和不可逆激活，因此，目前现有的opto-XR存在应用局限性【5】。

理想的optp-XR应具备以下特质：（1）快速可逆光激活；（2）适度光敏性（以避免因背景光激活所来带的干扰）；（3）与光遗传学技术光谱性能的强匹配度【6】。此外，理想的视蛋白（opsin），除了能够与GPCRs很好的偶联之外，也能够发挥直接性的神经元抑制作用，比如突触投射抑制【6】。

2021年5月11日，在以A photoswitchable GPCR-based opsin for presynaptic inhibition为题发表在Neuron的最新论文中，美国华盛顿大学医学院的Michael R. Bruchas研究团队通过一种存在于七鳃鳗视蛋白parapinopsin（PPO）在体内/外实现对神经元的快速、可重复，长效且可逆的抑制。PPO的活性可被蓝光激活，而绿光/琥珀色光则可抑制其活性。PPO偶联内源的GPCRs信号通路级联，进而抑制突触前末端神经递质的释放，从而调节神经元的抑制性活动以及小鼠的奖赏寻求行为。

PPO是一种非视觉性的G蛋白亚基Gi/o抑制性偶联的视蛋白，表达于七鳃鳗的松果体中，在紫外线和绿光（或琥珀光）照射下，PPO可以被光激活或光抑制【7-8】。文中，首先，研究者应用G蛋白易位成像分析（检测G蛋白亚基βγ），以更精确地定义PPO信号在体外的光谱和时间特性。在无光照（即黑暗）条件下，PPO稳定表达于HeLa细胞和纹状体神经元的细胞膜上，当有紫外光（365nn）或蓝光（470nn）照射时，PPO快速向细胞内转运，此时，再当有琥珀光（595nn）照射时，PPO重新回归到膜上。因此，PPO可以被紫外光或被蓝光激活，被琥珀色光关闭。作者也验证了PPO与多光子成像的相结合应用：700nn处PPO有最大激活，1000nn以上PPO激活下降且出现杂波干扰。

随后，作者测试了PPO是否通过介导下游效应子，如G蛋白偶联的内向整流K ⁺通道（GIRK），以实现对神经元树突和胞体的抑制。具体地，在HEK细胞中共表达GIRK2A通道（蛋白）与PPO-Venus并以光刺激，发现，蓝光及紫外光均能快速激活GIRK电流，且紫外光激活GIRK的速度更快，然而，此时再用琥珀色光进行去激活（即关闭PPO）时，发现紫外光激活状态下的GIRK电流衰变缓慢，呈稳定衰变趋势，而蓝光状态下呈快速衰变。换句话说，紫外光和蓝光可引起PPO与GIRK通道的差异性偶联，从而使PPO激活和关闭的动力学不同，蓝色可使PPO持续性激活，也可使其快速关闭。  

接下来，作者将PPO表达于小鼠脑腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能（DA）神经元，以研究其对神经元活动和小鼠行为的调节及其调节机制。首先，研究发现，PPO可以偶联内源GIRK，且在蓝光照射下，PPO被激活，DA神经元胞体的神经活动被抑制，进而小鼠的奖赏寻求行为被抑制，这表明：PPO通过调节VTA DA神经元来抑制小鼠奖赏寻求行为。而且，在小鼠原代背根节（DRG）神经元中，蓝光激活之下，PPO偶联内源GPCRs池（G蛋白亚基βγ，GABA_BRs），即PPO通过一种依赖于电压门控的机制，快速和可逆地抑制DRG神经元的电压门控Ca²⁺通道（VGCC）电流，且具有很好的光敏感性。

突触前G蛋白亚基Gi/o抑制性偶联GPCRs，如GABA_BRs，可以通过VGCC功能和干扰释放机制等多种机制抑制囊泡释放，对突触信号传递发挥强大的控制作用【9】。在此，作者在小鼠丘脑腹后内侧核（VPM）表达了PPO，并发现PPO可被有效转运至轴突末端（即突触后），提示了PPO控制突触前释放；并且，蓝光照射下，激活的PPO可以抑制初级躯体感觉皮质的兴奋性投射，提示了PPO的一种突触前抑制机制。

进一步地，作者证明，蓝光激活的PPO通过偶联伏隔核（VAs）内源的GPCRs信号转导级联（如GABA_BRs），抑制GABA能抑制性突触后电流，进而干扰或抑制突触前末端神经递质的释放，从而抑制突触前到突触后的信号传递。而琥珀光可解除蓝光激活下的PPO突触前抑制，表明了PPO对神经突触前释放（谷氨酸、GABA、多巴胺）的可逆性光抑制。

再进一步地，作者验证了PPO体内可逆性抑制突触前末端释放的效果。首先，蓝光激活的PPO可以抑制GABA能从纹终核（BNST）到外侧下丘脑（LH）的投射，BNST终端的抑制则会导致突触后LH活性的去抑制（即解除LH活性抑制）；而且PPO能够与RdLight1（一种红移生物传感器）相兼容，更加有效地抑制体内神经突触前终端释放。另外，PPO光激活抑制VAs DA突触前末端释放可显著抑制小鼠用鼻子主动触碰奖赏物的行为和奖赏物获取量，即小鼠机动性行为和赏寻求行为被抑制，而且这种行为学变化是PPO激活时间依赖性的，且可逆的（即绿光激活下小鼠行为抑制别解除）。因此，实验验证了PPO抑制神经元的实用性。

文章总结图：一种基于GPCR的可光控（蓝光开启琥珀色光关闭）的突触前抑制性视蛋白

（图片引自：Copits et al., 2021, Neuron 2021, 109: 1–19）  

文章结论与讨论

研究发现PPO是一种通过抑制GPCR信号级联快速、可逆控制神经调节的有效光遗传学工具。 通过与进化保守的内源性抑制机制（如GIRK、VGCC、GABA_BRs等内源性信号）偶联，可被脉冲蓝光快速激活，被琥珀色光关闭，且不易被环境光干扰。并且PPO与下游GIRK、VGCC等内源性信号偶联，可重复性的、持续性和可逆性的有效抑制神经元突触前末端神经递质（如谷氨酸、GABA、多巴胺）释放，进而有效抑制神经兴奋性。此外，PPO在体内以一种依赖激活时间，可逆的方式调节小鼠的机动性行为和奖赏寻求行为。

这项研究表明：PPO填补了神经科学研究工具中快速可逆突触抑制的重要空白，并在抑制性GPCR信号级联的准确时空控制方面具有广泛的用途。更广泛地说，实现对神经调节信号的精确光学控制将为GPCR信号在体内与临床重要药物靶点相关的时空特性研究提供了基础。然而，PPO是否可以与不同细胞类型中的不同信号级联偶联或参与突触前可塑性机制仍待研究。

原文连接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.04.026 

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】Kim, C.K., Adhikari, A., and Deisseroth, K. (2017). Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222–235 

【2】Rost, B.R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., and Hegemann, P. (2017). Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron 96, 572–603. 

【3】Atasoy, D., and Sternson, S.M. (2018). Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiol. Rev. 98, 391–418.

【4】Airan, R.D., Thompson, K.R., Fenno, L.E., Bernstein, H., and Deisseroth, K. (2009). Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature 458, 1025–1029. 

【5】Ernst, O.P., Lodowski, D.T., Elstner, M., Hegemann, P., Brown, L.S., and Kandori, H. (2014). Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126–163 

【6】Wiegert, J.S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., and Yizhar, O. (2017). Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. Neuron 95, 504–529. 

【7】Koyanagi, M., and Terakita, A. (2014). Diversity of animal opsin-based pigments and their optogenetic potential. Biochim. Biophys. Acta 1837, 710–716. Koyanagi, M., Kawano, E., Kinugawa, Y., Oishi, T., Shichida, Y., Tamotsu, S., and Terakita, A. (2004). Bistable UV pigment in the lamprey pineal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 6687–6691. 

【8】Kawano-Yamashita, E., Koyanagi, M., Wada, S., Tsukamoto, H., Nagata, T., and Terakita, A. (2015). Activation of transducin by bistable pigment parapinopsin in the pineal organ of lower vertebrates. PLoS ONE 10, e0141280 

【9】Blackmer, T., Larsen, E.C., Takahashi, M., Martin, T.F., Alford, S., and Hamm, H.E. (2001). G protein betagamma subunit-mediated presynaptic inhibition: regulation of exocytotic fusion downstream of Ca2+ entry. Science 292, 293–297. 

制版︱王思珍

本文完